Todos los procedimientos relacionados con la recolección de muestras se han realizado de acuerdo con las directrices del IRB del instituto.
>1. Disección del cerebro de rata o ratón
NOTA: Se pueden utilizar tanto ratones como ratas. También se pueden utilizar animales mayores de P8 (probamos hasta P12), pero la extirpación de las meninges será cada vez más difícil. Además, el rendimiento y la salud de las células disminuirán, ya que las células cerebrales de los animales más viejos habrán formado procesos y conexiones intrincados que pueden romperse durante la disociación de los tejidos, lo que lleva a una mayor muerte celular. Aquí se describen las preparaciones corticales, pero también se pueden utilizar otras regiones del cerebro.
- Coloque tripsina-EDTA al 0,05% en un baño de agua a 37 °C.
- Sacrificar animales (ratas preñadas para cachorros E19 o animales P0-P8) aumentando lentamente la concentración deCO2 y aislando los cerebros. Los siguientes pasos requieren una técnica estéril.
- Si trabaja con tejido embrionario, primero extraiga los embriones del útero y abra los sacos embrionarios, luego corte inmediatamente las cabezas con unas tijeras. Cuando se hayan cortado todas las cabezas, transfiéralas a un medio de disección preenfriado.
- Una vez que las cabezas estén sumergidas en el medio, abra la piel y el cráneo (ambos son muy blandos en animales jóvenes) con fórceps y pellizque el cerebelo. Con cuidado, levanta el resto del cerebro y sácalo del cráneo.
nota: De dos a cuatro embriones E19 producen suficiente tejido para al menos ocho placas de 10 cm de astrocitos corticales con 500.000 células por placa el día de la disección.
- En el caso de los cachorros recién nacidos o mayores, corte las cabezas con unas tijeras y aísle los cerebros cortando la piel medialmente en línea recta desde la parte posterior de la cabeza hasta la punta de la nariz. Aparta la piel y corta con cuidado el cráneo de izquierda a derecha, luego levanta el hueso del cráneo. Corta el cerebelo y saca el resto del cerebro del cráneo hacia arriba y hacia afuera
nota: Dos o tres crías de P0-P8 producen suficiente tejido para al menos ocho placas de 10 cm de astrocitos corticales con 500.000 células por placa el día de la disección.
- Separa la corteza de la estructura subyacente del mesencéfalo. Coloque las pinzas dentro de la fisura longitudinal entre los hemisferios, luego mueva las pinzas entre la corteza y las estructuras del mesencéfalo de un hemisferio (perpendicular a la fisura longitudinal) para pellizcar cada hemisferio y liberarlo.
- Con las pinzas, retira todas las meninges de cada hemisferio (y su hipocampo) y luego separa los hipocampos. Si se requieren astrocitos del hipocampo, mueva cada hipocampo a un tubo de 15 mL lleno de medio de disección de 14 mL en hielo.
- Elimine más áreas de la corteza de cada hemisferio si se requieren regiones específicas (por ejemplo, la corteza frontal). Cortar cualquier tejido cortical que se vaya a utilizar para generar astrocitos en pedazos de no más de 1 mm3. Recoja todos los trozos de tejido cortical en un tubo separado de 15 ml lleno de un medio de disección en hielo.
>2. Digestión y disociación de tejidos
- Una vez que se hayan recogido todos los trozos de tejido, espere a que se asienten en el fondo del tubo, luego aspire la mayor cantidad de medio posible.
- Añadir 2-3 mL de tripsina-EDTA al 0,05% con una pipeta serológica e incubar los tubos en un baño de agua a 37 °C durante 20 min.
nota: Libere rápidamente toda la tripsina-EDTA de la pipeta para mezclar los trozos de tejido y dejar que se asienten de nuevo.
- Aspire cuidadosamente la tripsina-EDTA, dejando los trozos de tejido en la menor cantidad de líquido posible, en el fondo del tubo.
- Agregue 5 mL de medio de disección preenfriado para lavar la tripsina-EDTA restante. Pipetear hacia el lado de la parte superior del tubo para lograr la mezcla de las piezas de tejido.
- Aspire el medio de disección y deje los trozos de tejido en la menor cantidad de líquido posible. Repita este paso de lavado con medio de disección preenfriado dos veces más.
- Después del último paso de lavado, añadir 1 mL de DMEM+ (calentado a temperatura ambiente) con una punta de pipeta de 1.000 μL y triturar el tejido pipeteando hacia arriba y hacia abajo sin introducir burbujas.
nota: Es importante evitar la producción de burbujas, ya que esto puede cambiar el pH de la solución, a la que los astrocitos son bastante sensibles.
- Coloque un filtro de células de 100 μm en la abertura de un tubo de 50 ml y humedezca previamente el filtro con 4,5 ml de DMEM+ preenfriado.
- Pipetee 1 mL de suspensión de tejido disociado en el filtro de células y agregue otros 4,5 mL de DMEM+ preenfriado para lavar las células a través del filtro de células.
>3. Células de paso
- El día antes del paso, cubra las placas de cultivo celular con 0,04% de PEI.
- El día in vitro (DIV) 7 después de la disección, coloque las placas de 10 cm con células en DMEM+ en un agitador de laboratorio en la incubadora y agite las placas a 110 rpm durante 6 h.
- Lave dos veces el PEI de los cubreobjetos recubiertos con agua destilada desionizada. Agregue medio NB+H a las placas (500 μL por pocillo para placas de 24 pocillos y 2 mL por pocillo para placas de 6 pocillos). Preequilibre las placas en la incubadora a 37 °C y 5% de CO2 mientras las placas de 10 cm están agitadas, o durante al menos 30 minutos.
- 20-30 minutos antes del final de las 6 horas de agitación, precalentar 1x PBS, DMEM+, NB+H y tripsin-EDTA al 0,25% a 37 °C en el baño de agua.
- Después de 6 h de agitación, retire las placas de cultivo del agitador y reemplace inmediatamente el medio (que contiene neuronas sacudidas, oligodendrocitos y microglía) con 10 mL precalentado 1x PBS por plato.
nota: Es importante aspirar inmediatamente el medio viejo que contiene células desprendidas para evitar que las células no astrocíticas se vuelvan a unir.
- Retire el PBS y agregue 3 mL de tripsina-EDTA precalentada por plato. Incubar cada placa durante 4 min en la incubadora a 37 °C y 5% deCO2
- Añada 5 mL de DMEM+ precalentado a los 3 mL de tripsina-EDTA en cada placa, pipetee las células de la placa con una pipeta serológica de 5 mL y recoja la suspensión celular en un tubo de 50 mL.
nota: Pipetea directamente desde el fondo de la placa: el suelo de la placa debe aclararse a medida que las células se desprenden. Utilice únicamente un medio que contenga suero (en lugar de DMEM+), ya que el suero inactiva la tripsina.
- Centrifugar la suspensión de la célula a 3.220 x g a 20 °C durante 4 min.
- Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en 1 mL de NB+H precalentado.
>4. Siembra celular para cultivos finales de astrocitos
- Cuenta las celdas.
- Placa de 20.000 células por pocillo en placas de 6 pocillos (en medio NB+H de 2 mL por pocillo) o 5.000 células por pocillo en placas de 24 pocillos (en medio NB+H de 500 μL por pocillo).
- Mantenga los cultivos celulares en la incubadora a 37 °C y 5% de CO2 hasta el tratamiento o análisis adicional.
