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Todos los procedimientos relacionados con la recolección de muestras se han realizado de acuerdo con las directrices del IRB del instituto.
1. Diferenciación de hiPSCs rtTA/Ngn2-positivas a neuronas en MEAs de 6 pocillos y cubreobjetos de vidrio
NOTA: En este protocolo, se proporcionan los detalles para diferenciar las hiPSCs rtTA/Ngn2-positivas en dos sustratos diferentes, es decir, MEAs de 6 pocillos (dispositivos compuestos por 6 pocillos independientes con 9 microelectrodos de registro y 1 microelectrodo incrustado de referencia por pocillo) y cubreobjetos de vidrio en los pocillos de una placa de 24 pocillos. Los protocolos, sin embargo, se pueden adaptar fácilmente para sustratos más grandes (por ejemplo, para los pocillos de placas de 12 o 6 pocillos), escalando los valores mencionados de acuerdo con el área de superficie.
- Preparar los MEAs o cubreobjetos de vidrio (día 0 y día 1)
- El día antes del inicio de la diferenciación, esterilizar los MEAs según la recomendación del fabricante.
- Diluir la proteína de adhesión Poly-L-Ornitina (PLO) en agua ultrapura estéril hasta una concentración final de 50 μg/mL. Cubra el área del electrodo activo de los MEA de 6 pocillos colocando una gota de 100 μL del PLO diluido en cada pocillo. Coloque los cubreobjetos en los pocillos de la placa de 24 pocillos con pinzas estériles. Añadir 800 μL del PLO diluido en cada pocillo. Evite que los cubreobjetos floten empujándolos hacia abajo con la punta de pipeta de 1000 μL.
- Incubar los MEAs de 6 pocillos y la placa O/N de 24 pocillos en una incubadora humidificada a 37 °C con una atmósfera de 5% de CO2. Al día siguiente, aspire el PLO diluido. Lave las superficies de vidrio de los MEA de 6 pocillos y los cubreobjetos dos veces con agua ultrapura estéril.
- Diluya la laminina en DMEM/F12 frío hasta una concentración final de 20 μg/mL (para los MEA de 6 pocillos) y 10 μg/mL (para los cubreobjetos de vidrio). Cubra inmediatamente el área del electrodo activo de los MEA de 6 pocillos colocando una gota de 100 μL en cada pocillo. Del mismo modo, agregue 400 μL de la laminina diluida en cada pocillo de la placa de 24 pocillos para cubrir los cubreobjetos. Evite que los cubreobjetos floten empujándolos hacia abajo con la punta de pipeta de 1.000 μL.
- Incubar los MEAs de 6 pocillos y la placa de 24 pocillos en una incubadora humidificada a 37 °C con una atmósfera de 5% de CO2 durante al menos 2 h.
- Placa de los hiPSCs (día 1)
NOTA: Los volúmenes que se mencionan en los pasos 3.2.1 a 3.2.4 suponen que las hiPSC rtTA/Ngn2 positivas se cultivan en una placa de 6 pocillos y que se recolectan las células de un pocillo. Los volúmenes necesarios para revestir las células en los MEA de 6 pocillos y/o los cubreobjetos dependen del número de MEA de 6 pocillos y/o del número de cubreobjetos que se utilicen en el experimento; Los números especificados en los pasos 3.2.6 a 3.2.8 permiten escalar a diferentes tamaños de experimento.
- Calentar el medio DMEM/F12, CDS y E8 con penicilina/estreptomicina al 1% (v/v) en R/T. Añadir doxiciclina hasta una concentración final de 4 μg/mL e inhibidor de ROCK hasta el medio E8.
- Aspire el medio gastado de las hiPSC rtTA/Ngn2 positivas y añada 1 mL de CDS a las hiPSCs. Incubar de 3 a 5 min en una incubadora humidificada a 37 °C con una atmósfera de 5% deCO2. Compruebe al microscopio si las células se están desprendiendo unas de otras.
- Añada 2 mL de DMEM/F12 en el pocillo, suspenda suavemente las células con una pipeta de 1.000 μL y transfiera las células a un tubo de 15 mL. Añadir 7 mL de DMEM/F12 a la suspensión celular. Girar las celdas a 200 x g durante 5 min.
- Aspirar el sobrenadante y añadir 2 mL del medio E8 preparado. Disocie las hiPSC colocando la punta de una pipeta de 1.000 μL contra el lateral del tubo de 15 mL y resuspendiendo las células suavemente. Compruebe al microscopio si las células están disociadas.
- Determine el número de células (células/mL) utilizando una cámara de hemocitómetro.
nota: Un pozo de placa de 6 pocillos con una confluencia del 80 al 90% normalmente producirá de 3,0 a 4,0 x 106 celdas en total.
- Aspirar la laminina diluida. Para los MEA de 6 pocillos, diluya las células para obtener una suspensión celular de 7,5 x 105 células/mL. Coloque la placa de las celdas agregando una gota de 100 μL de la suspensión de la celda en el área del electrodo activo en cada pocillo de los MEA de 6 pocillos. Para los cubreobjetos, diluya las células para obtener una suspensión celular de 4,0 x 104 células/mL. Coloque la placa de las células añadiendo 500 μL de la suspensión de la célula a los pocillos de la placa de 24 pocillos.
nota: La densidad final de células en los MEAs es mayor que en los cubreobjetos (Figura 1A y B). Descubrimos que esta alta densidad de celdas era necesaria para registrar correctamente la actividad de la red. En el protocolo, se proporcionan los números que fueron óptimos para los ensayos.
- Coloque los MEA de 6 pocillos y la placa de 24 pocillos en una incubadora humidificada a 37 °C con una atmósfera de 5% de CO2 durante 2 h (MEAs) o O/N (placa de 24 pocillos).
- Después de 2 h, agregue con cuidado 500 μL del medio E8 preparado a cada pocillo de los MEA de 6 pocillos. Coloque los MEA de 6 pocillos O/N en una incubadora humidificada a 37 °C con una atmósfera de 5% de CO2.
- Cambiar el medio (día 2)
- Al día siguiente, prepare DMEM/F12 con un suplemento de N-2 al 1% (v/v), aminoácidos no esenciales al 1% (v/v) y penicilina/estreptomicina al 1% (v/v). Añadir neurotrofina-3 recombinante humana (NT-3) a una concentración final de 10 ng/mL, factor neurotrófico derivado del cerebro recombinante humano (BDNF) a una concentración final de 10 ng/mL y doxiciclina a una concentración final de 4 μg/mL. Calentar el medio a 37 °C.
- Añadir laminina al medio hasta una concentración final de 0,2 μg/mL. Filtre el medio resultante. Aspire el medio gastado de los pocillos de los MEA de 6 pocillos y la placa de 24 pocillos y reemplácelo con el medio preparado. Incubar los MEAs de 6 pocillos y la placa O/N de 24 pocillos en una incubadora humidificada a 37 °C con una atmósfera de 5% de CO2.
- Añadir astrocitos de rata (día 3)
NOTA: Los volúmenes que se mencionan en este protocolo asumen que los astrocitos de rata se cultivan en matraces de cultivo T75. Es fundamental que los astrocitos de rata que se añaden a los cultivos sean de buena calidad. Utilizamos dos criterios para comprobar si los astrocitos de rata son de buena calidad. En primer lugar, el cultivo de astrocitos de rata debería ser capaz de crecer confluente dentro de los diez días posteriores al aislamiento de los cerebros embrionarios de rata. En segundo lugar, después de dividir el cultivo de astrocitos de rata, los astrocitos de rata deberían ser capaces de formar una monocapa confluente y teselada (Figura 1C). Si el cultivo de astrocitos de rata no cumple con estos dos criterios, aconsejamos no utilizar este cultivo para experimentos de diferenciación.
- Calentar tripsina-EDTA al 0,05% a RT. Calentar el DPBS y el DMEM/F12 con penicilina/estreptomicina al 1% (v/v) a 37 °C.
- Aspirar el medio gastado del cultivo de astrocitos de rata. Lave el cultivo agregando 5 mL de DPBS y agítelo suavemente.
- Aspirar el DPBS y añadir 5 mL de tripsina-EDTA al 0,05%. Agite suavemente la tripsina-EDTA. Incubar en una incubadora humidificada a 37 °C con una atmósfera de 5% de CO2 durante 5 - 10 min.
- Compruebe al microscopio si las células están desprendidas. Separe las últimas celdas golpeando el matraz unas cuantas veces.
- Añadir 5 mL de DMEM/F12 al matraz. Triturar suavemente las células dentro del matraz con una pipeta de 10 mL. Recoja la suspensión celular en un tubo de 15 mL. Girar el tubo a 200 x g durante 8 min.
- Aspirar el sobrenadante y resuspender las células en 1 mL de DMEM/F12. Determine el número de células (células/mL) utilizando una cámara de hemocitómetro.
- Agregue 7.5 x 104 astrocitos por pocillo de los MEA de 6 pocillos. Agregue 2.0 x 104 astrocitos por pocillo de la placa de 24 pocillos. Incubar los MEAs y la placa O/N de 24 pocillos en una incubadora humidificada a 37 °C con una atmósfera de 5% de CO2.
- Cambiar el medio (día 4)
- Prepare el medio neurobasal con un suplemento de B-27 al 2% (v/v), L-alanil-L-glutamina al 1% (v/v) y penicilina/estreptomicina al 1% (v/v). Agregue NT-3 a una concentración final de 10 ng/mL, BDNF a una concentración final de 10 ng/mL y doxiciclina a una concentración final de 4 μg/mL. Además, agregue citosina β-D-arabinofuranósido a una concentración de 2 μM.
NOTA: La citosina β-D-arabinofuranósido se añade al medio para inhibir la proliferación de astrocitos y matar las hiPSC restantes que no se diferencian en neuronas.
- Filtre el medio y caliente a 37 °C. Aspire el medio gastado de los pocillos de los MEA de 6 pocillos y la placa de 24 pocillos y reemplácelo con el medio preparado. Mantenga los MEA de 6 pocillos y la placa de 24 pocillos en una incubadora humidificada a 37 °C con una atmósfera de 5% de CO2.
- Refrescar el medio (día 6 - 28)
NOTA: A partir del día 6, refresque la mitad del medio cada dos días. A partir del día 10, el medio se complementa con FBS para apoyar la viabilidad de los astrocitos.
- Prepare el medio neurobasal con un suplemento de B-27 al 2% (v/v), L-alanil-L-glutamina al 1% (v/v) y penicilina/estreptomicina al 1% (v/v). Agregue NT-3 a una concentración final de 10 ng/mL, BDNF a una concentración final de 10 ng/mL y doxiciclina a una concentración final de 4 μg/mL. A partir del día 10, complemente también el medio con un 2,5% (v/v) de FBS. Filtrar el medio resultante y calentarlo a 37 °C.
- Extraiga la mitad del medio gastado de los pocillos de los MEA de 6 pocillos y de la placa de 24 pocillos con una pipeta de 1000 μL y sustitúyala por el medio preparado. Mantenga los MEA de 6 pocillos y la placa de 24 pocillos en una incubadora humidificada a 37 °C con una atmósfera de 5% de CO2.
