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Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Preparación de bolas de neuronas como cultivo de gota colgante (Días in vitro (DIV) 0-3)
NOTA: Los procedimientos descritos aquí para la preparación del cultivo de bolas de neuronas se basan en el método previamente informado por el grupo de Sasaki con algunas modificaciones. También adoptamos varios procedimientos del método bancario para la cultura disociada.
- Confirmar lo siguiente antes de comenzar la disección
- Prepare todas las soluciones necesarias y esterilícelas por autoclave/filtración con anticipación.
- Tenga a mano todos los instrumentos y materiales que se utilizarán en cada paso de este cultivo de neuronas corticales.
- Rocíe y limpie la cabina de flujo de aire laminar, la mesa de disección, la placa de etapa del microscopio estereoscópico, las tijeras y las pinzas con etanol al 70%.
- Sacrificar al ratón tras la aplicación de CO2 y diseccionar el abdomen para obtener embriones E16.
- Extraiga los cerebros de los embriones con cuidado con la ayuda de puntas finas de pinzas y transfiéralos a placas de cultivo celular de 60 mm que contengan 4 mL de ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanosulfónico, solución salina tamponada HEPES (HBSS).
nota: El medio de disección HBSS contiene 10 mM de HEPES (pH 7,4), 140 mM de cloruro de sodio (NaCl), 5,4 mM de cloruro de potasio (KCl), 1,09 mM de hidrogenofosfato disódico (Na2HPO4), 1,1 mM de fosfato de dihidrógeno de potasio (KH2PO4), 5,6 mM de D-glucosa y 5,64 μM de rojo de fenol.
- Extraer el cuero cabelludo, cortar el bulbo olfativo, separar las cortezas de cada hemisferio cerebral con las puntas finas de las pinzas bajo un microscopio estereoscópico y transferir a otras placas de 60 mm que contengan HBSS fresco. Use al menos 3-5 embriones para cada cultivo de bolas de neuronas por separado.
- Corte las cortezas en trozos pequeños con tijeras de resorte de microdisección en una campana de cultivo celular de flujo laminar.
- Transfiera las cortezas picadas a un tubo de 15 mL y tripsinícelas en 4 mL de tripsina al 0,125% en HBSS durante 4,5 min en un baño de agua a 37 °C.
nota: Este tiempo de tripsinización es crítico para un cultivo eficiente de neuronas, ya que el aumento del tiempo (> 4,5 min) conduce a muchas más neuronas muertas.
- Transfiera los agregados celulares a un nuevo tubo de 15 mL que contenga 10 mL de HBSS mediante una pipeta de transferencia estéril e incube a 37 °C durante 5 min. Repita este paso una vez más.
- Transfiera los agregados celulares a un nuevo tubo de 15 mL que contenga 2 mL de medio Neurobasal que contenga GlutaMax, suplemento de B27 (medio NGB), 0,01% de DNasa I y 10% de suero de caballo.
- Triturar las cortezas tripsinizadas pipeteándolas repetidamente hacia arriba y hacia abajo (3-5 veces) con una pipeta Pasteur de vidrio fino pulido al fuego.
nota: El diámetro de una pipeta Pasteur de vidrio fino pulido al fuego es muy importante, tal y como se describe en el documento del método Banker. Si la pipeta es demasiado estrecha para pasar las cortezas, prepare pipetas que posean 2-3 tamaños diferentes y pruebe con una pipeta más grande.
- Para preparar bolas de neuronas, tome la suspensión celular anterior y ajuste la densidad celular a 1 x 106 celdas/mL usando un medio NGB.
- Cultive las neuronas corticales como gotas colgantes que contienen 10.000 células/gota (1 gota es 10 μL) dentro de los párpados superiores de placas de cultivo de 10 cm.
- Añadir 7 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) a la parte inferior de las placas de cultivo, luego mantener en una incubadora durante 37 días a 37 °C con 5% de CO2 en condiciones de humidificación para permitir la formación de bolas de neuronas.