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1. Preparación de cultivo de la neurona ganglionar de la raíz dorsal adulta disociada o neurona DRG
- Antes de configurar el cultivo, recubra previamente una placa de 6 pocillos con poli-D-lisina y laminina. Incubar una placa de 6 pocillos con 0,01% de poli-D-lisina a 37 °C durante 2 h o a 4 °C durante la noche. Luego, lave el plato dos veces con agua destilada.
- Incubar la placa con solución de laminina a una concentración de 3 μg/mL durante 2 h a temperatura ambiente y, a continuación, lavar la placa dos veces con agua destilada. Seque la placa a temperatura ambiente durante al menos 1 h.
- Eutanasia a un ratón en una cámara transparente de CO2 conectada a un cilindro de gas CO2 comprimido. Incidir la piel que recubre la columna vertebral con una cuchilla quirúrgica y diseccionar los músculos paravertebrales bilateralmente para exponer los huesos vertebrales. Extirpe los huesos vertebrales meticulosamente con un rongeur quirúrgico de punta estrecha hasta que los DRG estén completamente expuestos.
nota: Las neuronas DRG adultas se obtienen de ratones machos C57BL6 adultos de entre 8 y 12 semanas de edad.
- Retire los GRD bilateralmente desde el S1 hasta el nivel C1 utilizando tijeras de iridectomía y pinzas de punta fina bajo un microscopio de disección. Trate de cortar las raíces por completo de los DRG para minimizar la contaminación de las células de Schwann o fibroblastos.
- Guarde los DRG disecados en una placa de Petri de 60 mm que contenga 5 mL de Medio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) frío en hielo hasta que todos los DRG sean el siguiente paso, incluso si todavía quedan DRGs.
nota: Es fundamental diseccionar los GRD lo más rápido posible. La recolección de todos los DRG de un ratón no debe tomar más de 30 min. 30 min después de la eutanasia, deje de recolectar los DRG y proceda a transferir los DRG a un tubo Eppendorf de 1,5 mL usando una punta de pipeta azul (1000 μL) con un extremo de corte. Retire el DMEM después de un centrifugado rápido durante varios segundos con una mini centrífuga. Añadir 1 mL de DMEM que contenga 125 U/mL de colagenasa tipo XI e incubar el tubo durante 90 min con una rotación suave (35-40 rpm) utilizando un agitador twister en una incubadora a 37 °C. Inmovilice el tubo en el piso del agitador con la cinta.
- Deseche el DMEM que contenga colagenasa y agregue 1 ml de DMEM fresco. Espere hasta que los DRG flotantes se hundan completamente hasta el fondo y luego retire el DMEM con los restos de tejido. Repita este paso de lavado al menos seis veces.
nota: No intente desechar el sobrenadante por completo. Tenga cuidado de no eliminar ningún DRG con el sobrenadante DMEM.
- Transfiera los DRG a un tubo cónico de 15 mL con una punta de pipeta azul (1000 μL) con un extremo de corte. A continuación, pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo al menos 15 veces con una punta azul (1000 μL) para crear una suspensión celular homogénea. Evite hacer burbujas y trate de no tocar el fondo del tubo cónico con la punta de una pipeta.
- Centrifugar el tubo a 239 x g durante 3 min y desechar con cuidado el sobrenadante con los residuos flotantes. Agregue 1 mL de medio Neurobasal suplementado con B27 (2.0% v/v) y resuspenda el pellet celular pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo de 5 a 10 veces.
- Pase la suspensión celular a través de un filtro celular de 70 μm superpuesto sobre un tubo cónico de 50 mL. Espere 2 minutos y, a continuación, vierta el medio Neurobasal/B-27 en el colador con un controlador de pipeta.
- Coloque todas las neuronas DRG recolectadas (aproximadamente 2 x 106 neuronas DRG de un ratón) en dos pocillos de placa de 6 pocillos. Las neuronas DRG de un ratón adulto cubren dos pocillos en una placa de 6 pocillos. A continuación, coloque la placa en una incubadora de CO2 a 37 °C hasta que los macrófagos se cocultiven.
2. Cocultivo de macrófagos peritoneales primarios en un inserto de cultivo celular
NOTA: Establecer los cocultivos 4 h después de la siembra inicial de las neuronas DRG disociadas
- Los macrófagos peritoneales primarios se preparan a partir de ratones machos C57BL6 adultos de entre 8 y 12 semanas de edad. Sacrificar a un animal en una cámara de CO2. Haga una incisión delicada en la piel abdominal, exponga el peritoneo y evite cortar el peritoneo para evitar la fuga de líquido de lavado.
- Punción del peritoneo con una jeringa con aguja de 22 g e inyecte 10 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) helada en la cavidad peritoneal. Masajear suavemente el peritoneo durante 1-2 min. Luego, extraiga la aguja y exprima el PBS a través del sitio de punción de la aguja, y recoja el líquido de lavado en un tubo cónico de 50 ml.
nota: Antes de usar, coloque la jeringa en hielo para mantener la frialdad del PBS.
- Centrifugar el líquido de lavado a 239 x g durante 10 min a 4 °C para granular los componentes celulares. Vuelva a suspender el pellet con 3 ml de tampón de lisis de glóbulos rojos (RBC) durante 3 min a temperatura ambiente. A continuación, vuelva a centrifugar la suspensión celular a 239 x g durante 10 min a 4 °C. Vuelva a suspender el pellet con 3 mL de PBS y vuelva a centrifugar la suspensión celular para eliminar cualquier resto de tampón de lisis RBC.
nota: Asegúrese de que el tampón de lisis RBC se haya eliminado por completo. De lo contrario, el tampón de lisis de glóbulos rojos restante puede ser tóxico para los macrófagos cultivados.
- Resuspender las células peletizadas en 1 mL de medio Neurobasal/B-27. Coloque la mitad de todos los macrófagos recolectados (un total de 3 × 106 a 6 x 106 células) en un inserto de cultivo celular con un área efectiva de 4,2cm2, que se coloca encima del pocillo de DRG.
disociado
nota: Durante el período de cocultivo, los macrófagos se cultivan en el medio de cultivo de neuronas Neurobasal/B-27. Se confirmó la supervivencia adecuada de los macrófagos en esta condición.
3. Tratamiento de db-cAMP (AMP dibutiril-cíclico) y recolección de macrófagos CM
NOTA: Iniciar el tratamiento con db-cAMP 4 h después de los cocultivos neurona-macrófago.
- Añadir 2 μL de solución de 100 μM db-cAMP a los cocultivos de neuronas y macrófagos. Agregue el mismo volumen de PBS para un experimento de control.
- Después de 24 h, llene un pocillo vacío con 1 mL de medio de cultivo de macrófagos en la misma placa de 6 pocillos. Transfiera el inserto de cultivo celular en los cocultivos de neuronas y macrófagos al pocillo vacío con un medio de cultivo de macrófagos. Mantenga las celdas en las mismas condiciones durante 72 horas sin cambiar el medio.
nota: Añadimos solo 1 mL de medio de cultivo de macrófagos durante la recolección de CM para hacer CM concentrado. Durante la recolección de CM, si era necesario, agregamos más para cubrir completamente los macrófagos dentro del inserto.
- Después de 72 h, centrifugar el macrófago CM a 239 x g durante 5 min para eliminar los componentes celulares. Pase el sobrenadante a través de un filtro de 0,2 μm para eliminar los restos celulares restantes. Guarde el CM recogido a -70 °C hasta su uso.