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>1. Tratamiento de Db-Camp y recolección de medio acondicionado con macrófagos
NOTA: Iniciar el tratamiento con db-cAMP 4 h después de los cocultivos neurona-macrófago.
- Añadir 2 μL de solución de 100 μM de AMP cíclico de dibutiril (db-cAMP) a los cocultivos de neuronas-macrófagos. Agregue el mismo volumen de salina tamponada con fosfato (PBS) para un experimento de control.
- Después de 24 h, llene un pocillo vacío con 1 mL de medio de cultivo de macrófagos en la misma placa de 6 pocillos. Transfiera el inserto de cultivo celular en los cocultivos de neuronas y macrófagos al pocillo vacío con medio de cultivo de macrófagos. Mantenga las celdas en las mismas condiciones durante 72 h sin cambiar el medio.
nota: Añadimos solo 1 mL de medio de cultivo de macrófagos durante la recolección del medio acondicionado (CM) para hacer CM concentrado. Durante la recolección de CM, si era necesario, agregamos más para cubrir completamente los macrófagos dentro del inserto.
- Después de 72 h, centrifugar el macrófago CM a 239 x g durante 5 min para eliminar los componentes celulares. Pase el sobrenadante a través de un filtro de 0,2 μm para eliminar los restos celulares restantes. Guarde el CM recogido a -70 °C hasta su uso.
>2. Ensayo de excrecencia de neuritas con CM recolectado
- Antes de establecer un cultivo de neuronas DRG adultas por separado, recubra previamente un portaobjetos de cámara de 8 pocillos con poli-D-lisina y laminina. Incubar una placa de 6 pocillos con 0,01% de poli-D-lisina a 37 °C durante 2 h o a 4 °C durante la noche. Luego, lave el plato dos veces con agua destilada.
- Incubar la placa con solución de laminina a una concentración de 3 μg/mL durante 2 h a temperatura ambiente y, a continuación, lavar la placa dos veces con agua destilada. Seque la placa a temperatura ambiente al menos durante 1 h.
- Obtener neuronas DRG adultas disociadas en medio Neurobasal suplementado con B27. Coloque 5 x 104 celdas por pocillo en el portaobjetos de la cámara de 8 pocillos prerrevestido.
- Coloque el portaobjetos de la cámara en una incubadora a 37 °C durante 2 h, permitiendo que las células se adhieran al fondo. A continuación, sustituya el medio de cultivo por el CM descongelado que se precalienta a 37 °C.
nota: Tenga cuidado de no tocar la parte inferior del portaobjetos de la cámara de 8 pocillos cuando retire el medio de cultivo y agregue el CM recolectado.
- 15 h después de la siembra inicial, retire el medio y lave las células con PBS una vez. A continuación, añadir 200 μL de solución helada de paraformaldehído al 4% a los pocillos e incubar las células con la solución de paraformaldehído durante 20 min a 4 °C
nota: El cultivo de neuronas DRG para el ensayo de excrecimiento de neuritas debe restringirse con precisión a 15 h. Bajo esta condición, no hay un crecimiento apreciable de neuritas.
- Lavar tres veces con PBS helado y luego realizar el bloqueo con suero de cabra normal (NGS) al 10% con Triton-X al 0,1% durante 30 min. Incubar las células fijas con solución de anticuerpo primario (anti-Tuj-1) diluida con NGS al 10% (a una concentración de 1 μg/mL) durante 4 h a temperatura ambiente o toda la noche a 4 °C.
- Lavar tres veces con PBS, y luego incubar las células con una solución de anticuerpo secundario (cabra-anti ratón) durante 2 h a temperatura ambiente. A continuación, lavar dos veces con PBS y montar el portaobjetos de cultivo con un cubreobjetos (24 × 50 mm) utilizando una solución de montaje.
- Tome imágenes con un microscopio de fluorescencia para visualizar el crecimiento de las neuritas (Figura 1).
