Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Preparación de la cámara microfluídica o MFC
- Fundición de PDMS en moldes primarios (Figura 1)
- Compre o cree moldes primarios (obleas) siguiendo un protocolo detallado.
- Utilice aire a presión para eliminar cualquier tipo de suciedad de la plataforma de la oblea antes de continuar con el paso de recubrimiento. La superficie de las obleas debe verse lisa y clara.
- Llene un recipiente con 50 mL de nitrógeno líquido. Prepare una jeringa de 10 ml y una aguja de 23 g.
nota: Todos los procedimientos a partir de este paso deben realizarse en una campana química.
- En la campana química, use la jeringa y la aguja para acumular 2 ml de nitrógeno líquido. Aunque parezca que se ha aspirado el aire, la jeringa está llena de nitrógeno (Figura 1A). Coloque el plato que contiene la oblea en un recipiente hermético.
- Enrosque un frasco de clorotrimetilsilano, perfore la tapa de goma con la jeringa llena de nitrógeno e inyecte todo el contenido de la jeringa en el frasco. Sin sacar la aguja, dé la vuelta al frasco y extraiga 2 mL de clorotrimetilsilano.
nota: Debido a la presión de la jeringa, se rocía una pequeña cantidad de clorotrimetilsilano de la aguja. Para evitar un peligro, apunte la aguja hacia la pared interior de la capucha (Figura 1B).
- Extienda el clorotrimetilsilano uniformemente en el recipiente (a partir del paso 1.1.4), pero no directamente sobre la oblea o la placa que contiene la oblea. Cierre el recipiente e incube durante 5 minutos por oblea.
nota: Si esta es la primera vez que la oblea se recubre con clorotrimetilsilano, se debe permitir una incubación de 1 h para cada oblea.
- No saque las obleas y el recipiente de la cubierta química durante 30 min.
cautela: El clorotrimetilsilano es altamente volátil.
- Pese la base de PDMS (consulte la tabla de materiales) en un tubo de 50 ml y agregue el agente de curado PDMS en una proporción de 16:1, respectivamente (por ejemplo, 47,05 g de base y 2,95 g de agente de curado). Mezcle durante 10 minutos con un rotador de baja velocidad.
- Vierta PDMS en cada placa que contenga obleas a la altura deseada (Figura 1C).
nota: El uso de cámaras microfluídicas delgadas (hasta 3-4 mm) mejora la adherencia a la placa de cultivo y evita fugas.
- Coloque todas las placas juntas dentro de un desecador de vacío durante 2 h (Figura 1E). Este proceso elimina el aire atrapado dentro del PDMS, eliminando así las burbujas de aire y formando un molde claro y uniforme.
- Coloque las placas dentro de un horno durante 3 h (o toda la noche) a 70 °C (Figura 1E).
nota: Los platos deben estar nivelados cuando se coloquen en el horno.
- Fundición de PDMS en moldes epoxi
nota: Debido a que la preparación de obleas es costosa, requiere un equipo especial y puede dañar las frágiles obleas, es posible generar réplicas epoxi de las obleas. Las réplicas son más baratas, más duraderas y se pueden utilizar para la producción en masa de cámaras microfluídicas.
- Moldee y cure el PDMS (como se describe en 1.1.8-1.1.11) en la oblea original.
- Retire y corte las partes sobrantes de PDMS, dejando solo los elementos microfluídicos y el área funcional necesaria para procesarlos en cámaras microfluídicas.
- Envuelva inmediatamente el PDMS con cinta adhesiva gruesa para evitar que acumule polvo.
- Elija un plato de plástico apto para el cultivo de tejidos que quepa en todo el PDMS en su interior y deje espacio para el epoxi a su alrededor. La distancia entre el PDMS y el plato de plástico debe ser inferior a 5 mm.
- Prepare una pequeña cantidad de PDMS mezclado en una proporción de 10:1 (base: agente de curado). El PDMS líquido fresco se utilizará para pegar el PDMS sólido en la parte inferior de la placa de plástico.
- Aplique una cantidad mínima de PDMS líquido en la parte inferior central de la placa de plástico y luego retire la cinta adhesiva del PDMS y adhiérala al fondo del plato de plástico. Asegúrese de que los elementos microfluídicos estén orientados hacia arriba.
- Deje que el PDMS se cure durante 30 minutos en un horno a 70 °C.
- Prepare la resina epoxi mezclando la base y el agente de curado en una proporción de 100:45, respectivamente en un tubo de ensayo. Diferentes resinas epoxi pueden tener diferentes proporciones de mezcla. El volumen requerido para una placa normal de 100 mm es de aproximadamente 40 mL.
- Deje que el epoxi se mezcle bien durante 10 minutos en un rotador hasta que la mezcla se vuelva visiblemente homogénea (es decir, no haya artefactos visibles similares a fibras en el líquido).
- Centrifugar la mezcla epoxi a 400 x g durante 5 minutos para eliminar las burbujas de aire atrapadas en el interior.
- Durante la centrifugación, extienda una fina capa de grasa de silicona alrededor de las paredes y todas las demás partes de plástico expuestas de la placa de cultivo. Esto evitará que el epoxi se polimerice con el plástico del plato y permitirá la eliminación del epoxi curado fácilmente al final del protocolo.
- Vierta el epoxi lentamente en el plato hasta que cubra completamente el PDMS y lo supere en al menos 5 mm. Evite la formación de burbujas dentro del epoxi manteniendo una distancia cero entre el tubo y la placa. Coloque la placa en un lugar seguro para que no se mueva durante las próximas 48 h.
- Después de 48 h, el epoxi debe estar completamente curado. Inserte la placa en un horno precalentado a 80 °C durante 3 h para el curado final.
- Retire el epoxi curado de la placa y del molde PDMS original tirando suavemente de la pared de plástico de la placa hasta que se rompa. A continuación, debe separarse fácilmente del epoxi y despegarse.
- Una vez extraído, limpie la grasa restante de la nueva réplica de epoxi e insértela boca abajo (es decir, con los elementos microfluídicos replicados hacia arriba) en una nueva placa de cultivo. La réplica de epoxi ya está lista para la fundición de PDMS.
- Use aire presurizado o N2 para soplar cualquier resto de PDMS o suciedad del molde de epoxi y enjuáguelo 2 veces con isopropanol. Llénalo por tercera vez e incuba durante 10 minutos en una placa agitadora orbital. Enjuague el molde nuevamente 3 veces con isopropanol y deseche el líquido restante. Secar con aire o N2 o colocar en un horno a 70 °C hasta que se seque.
nota: Siga los procedimientos de seguridad cuando trabaje con isopropanol y lo deseche.
- Mantenga las placas del molde cerradas hasta la fundición. Siga los pasos 1.1.8.-1.1.11.
- Punzonado y esculpido del PDMS en un MFC (Figura 2)
- Corta y retira el molde de PDMS del plato siguiendo las marcas (+) de las obleas con un bisturí. No use la fuerza, ya que los moldes son frágiles (Figura 2A).
- Siga las instrucciones dibujadas en el boceto para perforar y cortar las cámaras según la configuración experimental (Figura 2B-F).
- Para el cultivo de explantes de médula espinal (Figura 2C, E), perfore dos pocillos de 7 mm en el lado distal del MFC grande. Ubique los pozos de manera que se superpongan con los bordes del canal. En el lado proximal, perfore un pozo de 7 mm en el centro del canal, con un solapamiento mínimo, de modo que quede suficiente espacio para los explantes. Perfore dos orificios adicionales de 1 mm en los dos bordes del canal proximal. Gire el MFC con los elementos microfluídicos hacia arriba y, con una aguja de 20 G, talle tres pequeñas cuevas de explante en el pocillo perforado de 7 mm.
- Para el cultivo de MN disociado (Figura 2D, F), perfore cuatro pocillos de 6 mm en los bordes de los dos canales de un MFC pequeño.
- Esterilización del MFC para su uso en cultivos de tejidos
- Extienda bandas adhesivas de cinta adhesiva de 50 cm de largo en el banco. Presione y tire de la cámara hacia atrás para enfrentar la cinta adhesiva (tanto en la cara superior como en la inferior) y eliminar la suciedad cruda. Coloque las cámaras limpias en un plato nuevo de 15 cm.
nota: No presione directamente sobre los elementos microfluídicos cuando estos estén orientados hacia arriba.
- Incubar las cámaras en etanol de grado analítico al 70% durante 10 min en un agitador orbital.
- Deseche el etanol y seque las cámaras en una campana de cultivo de tejidos o en un horno a 70 °C.
- Colocación del MFC en un plato con fondo de vidrio
- Coloque la cámara en el centro de un plato con fondo de vidrio de 35 mm/50 mm de grado de cultivo de tejidos y aplique una fuerza menor en los bordes para que el PDMS y el fondo del plato se unan. Para evitar romper el fondo del vidrio, siempre aplique fuerza sobre una superficie sólida.
- Incubar durante 10 min a 70 °C. Presionar las cámaras para reforzar la adherencia a la placa.
- Incubar bajo luz ultravioleta durante 10 min.
- Recubrimiento y cultivo
- Agregue 1,5 ng/mL de poli-L-ornitina (PLO) a ambos compartimentos. Asegúrese de que el PLO esté pasando a través de los canales pipeteando el medio de recubrimiento varias veces directamente en la entrada del canal.
- Examine la cámara microfluídica bajo un microscopio óptico con un aumento de 10x para comprobar la presencia de burbujas de aire. Si las burbujas de aire bloquean las microranuras, coloque el MFC en un desecador de vacío durante 2 minutos. Más tarde, elimine el exceso de aire que quedó atrapado en los canales pipeteando el medio de recubrimiento a través de ellos. Incubar durante la noche.
- Reemplace PLO por laminina (3 μg/mL en DDW) para la incubación nocturna de la misma manera.
- Antes de la siembra, lavar la laminina con un medio de cultivo neuronal.
>2. Placas de cultivo neuronal
- Cultivo de explantes de médula espinal
- Con unas tijeras rectas y unas pinzas finas, diseccione una médula espinal de un embrión de ratón E12.5 ICR-HB9:GFP. Trabajar en una solución 1X HBSS con 1% de penicilina-estreptomicina (P/S) (Figura 3A-C).
- Con unas tijeras de microdisección, extirpe las meninges y los cuernos dorsales (Figura 3D).
- Corte la médula espinal en secciones transversales de 1 mm de grosor (Figura 3E). Deseche todo el medio del compartimento proximal del MFC.
- Tome un solo explante de médula espinal con una pipeta en un volumen total de 4 μL. Inyecte el explante lo más cerca posible de la cueva y extraiga el exceso de líquido del pocillo proximal a través de las salidas laterales (punzones de 1 mm). Los explantes deben ser succionados hacia el canal proximal.
- Agregue lentamente 150 μL de medio de explante de médula espinal (SCEX, ver Tabla de Materiales y Tabla 3) al pocillo proximal.
- Mantenimiento del cultivo de explantes de médula espinal
- Añada medio SCEX en el compartimento proximal y medio SCEX rico (SCEX con 50 ng/mL de BDNF y GDNF) en el compartimento distal. Mantener un gradiente de volumen de al menos 15 μL por pocillo entre los pocillos distales (mayor volumen) y el pocillo proximal.
- Refresque el medio cada 2 días. Los axones pueden tardar hasta 3-5 días en cruzar distalmente.
>3. Transporte axonal (Figura 4A)
- Marcaje de mitocondrias y compartimentos ácidos
- Prepare un medio SCEX fresco (o CNB para MN disociado) que contenga 100 nM de Mitotracker Deep Red FM y 100 nM de LysoTracker Red. Incubar durante 30-60 min a 37 °C. Se pueden utilizar otros colores siempre que sus fluoróforos no se superpongan.
- Lavar 3 veces con medio CNB/SCEX tibio. Las placas están listas para la obtención de imágenes.
- Imágenes en vivo
- Adquiera 100 series de imágenes de lapso de tiempo de transporte axonal a intervalos de 3 s, con un total de 5 minutos por película.
nota: El sistema de imágenes utilizado en este estudio incluyó un microscopio invertido equipado con disco giratorio confocal, controlado a través de un software de imágenes celular patentado, lente de aceite 60x, NA = 1.4, y una cámara EMCCD. Las películas se adquirieron en un ambiente controlado a 37 °C y 5% de CO2.
nota: Se pueden obtener imágenes de películas time-lapse más largas o más cortas, dependiendo del experimento. Incluso se pueden grabar películas durante la noche si es necesario. Sin embargo, es fundamental intentar reducir el tiempo de exposición y la potencia del láser, así como el número total de imágenes, para disminuir la fototoxicidad y el blanqueo durante la adquisición de películas.
