Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Preparación de materiales
- Esterilice todos los instrumentos y ddH2O utilizando un autoclave antes de realizar el experimento. Los instrumentos incluyen, entre otros, tijeras quirúrgicas, tijeras oftálmicas, fórceps, cucharas, divisores de núcleo, platos de vidrio (60-100 mm de diámetro) y vasos de precipitados de vidrio.
- Prepare la solución de Krebs (Tabla 1): Disuelva todos los productos químicos con ddH2O antes de usar. Disuelva CaCI2 por separado y agregue lentamente a la solución mezclada mientras revuelve para evitar sedimentos.
- Prepare el medio de enjuague, que consta de medios F12 con un 10 % de suero fetal bovino (FBS) y un 1 % de antibiótico/antimicótico (100x). Agregue 5 mL de FBS y 0,5 mL de antibiótico/antimicótico a 44,5 mL de medio F12.
- Prepare el medio neuronal A, que comprende el medio neurobasal A con 2% de B-27, 1% de FBS, 1% de L-glutamina, 1% de antibiótico/antimicótico (100x) y 0,1% de factor neurotrófico derivado de la glía (GDNF). Añadir 200 μL de B-27, 100 μL de FBS, 100 μL de L-glutamina, 100 μL de antibiótico/antimicótico (100x) y 10 μL de GDNF (10 μg/mL) a 9,5 mL de medio A neurobasal.
nota: Prepare el medio neuronal A dentro de una semana de uso para garantizar la frescura de B-27, L-glutamina y GDNF.
- Prepare el medio neuronal B utilizando el mismo procedimiento que la preparación del medio neuronal A, pero sin añadir FBS.
- Prepare la solución de digestión 1 disolviendo 20 mg de colagenasa tipo II, 6 mg de albúmina sérica bovina y 200 μL de antibiótico/antimicótico (100x) en 10 mL de solución de Krebs estable al oxígeno.
- Prepare la solución de digestión 2 diluyendo 1 mL de tripsina al 0.25% con 4 mL de solución salina balanceada de Hank.
- Prepare un plato con cubreobjetos recubiertos.
- Use pinzas en un banco de flujo laminar cuando coloque cubreobjetos de vidrio en una placa de cultivo de 48 pocillos.
- Diluir la poli-D-lisina con ddH2O hasta una concentración de 0,1 mg/mL como caldo de poli-D-lisina. Almacene el caldo a –20 °C y descongele antes
de
- Añada 40 μL de caldo de poli-D-lisina encima de cada cubreobjetos e incube la solución a temperatura ambiente durante 10 min.
nota: Ajuste la concentración a 4 μg/cm2 para diferentes placas con diferentes áreas basales. Por ejemplo, si el área basal de un pocillo de una placa de 24 pocillos es de 2cm2, debemos transferir 80 μL de caldo de poli-D-lisina a un pocillo. Cadacm2 contendría 4 μg de poli-D-lisina.
- Retire la poli-D-lisina de la placa de 48 pocillos y enjuague los cubreobjetos con ddH2O tres veces.
- Seque la placa en una campana de flujo laminar durante al menos 30 minutos para asegurarse de que la placa sea anhidra.
- Guarde la placa a 4 °C antes del recubrimiento de laminina durante 1 día como máximo. Es preferible almacenar la placa a -20 °C para el almacenamiento a largo plazo.
- Descongele la laminina a 4 °C. Diluya la laminina con ddH2O hasta una concentración de 50 μg/mL como material laminín. Almacene el caldo a –20 °C y descongele a 4 °C antes de usarlo.
- Utilice una pipeta para transferir 100 μL de laminina diluida a la parte superior de cada cubreobjetos e incube la laminina a 4 °C durante 1 h.
nota: Ajuste la concentración a 5 μg/cm2 para diferentes placas con diferentes áreas basales. Por ejemplo, si el área basal de un pocillo de una placa de 24 pocillos es de 2cm2, transfiera 200 μL de laminina diluida a un pocillo. Cadacm2 contendría 5 μg de laminina.
- Retire la solución de laminina y enjuague los cubreobjetos con ddH2O una vez. Realice esta operación en el borde del cubreobjetos para evitar raspados.
nota: Los cubreobjetos recubiertos pueden almacenarse a 4 °C durante 2 semanas como máximo.
>2. Recolección de vejiga
- Consigue ratas Sprague-Dawley de cinco semanas de edad.
- Infunda carbógeno (95% de oxígeno, 5% de CO2) en la solución de Krebs durante al menos 30 minutos en un baño de hielo para alcanzar un estado de oxígeno y un nivel de pH estables.
- Después de la eutanasia por luxación cervical, remojar las ratas en etanol al 75% durante 30 s para su esterilización.
- Coloque a las ratas sobre una toalla quirúrgica esterilizada y exponga su abdomen. Abra la cavidad abdominal y revele la vejiga con un juego de tijeras y pinzas.
- Levante la vejiga suavemente y corte la vejiga del cuello de la vejiga con otro juego de tijeras y pinzas para evitar la contaminación cruzada. Coloque la vejiga rápidamente en una solución Krebs fría y estable al oxígeno para mejorar la supervivencia celular.
nota: Una vez extraída la vejiga, se realizan rápidamente las siguientes operaciones para mejorar las perspectivas de supervivencia de las neuronas.
- Agregue la solución de Krebs en tres platos de vidrio y vasos de precipitados de vidrio.
- Prepare platos de vidrio y vasos de precipitados con solución de Krebs en un baño de hielo para preenfriar.
- Marque estos recipientes con los números del 1 al 3 correspondientes para evitar confusiones.
- Empareje cada plato de vidrio con pinzas y un divisor de núcleo de cucharas.
- En el plato de vidrio 1, corte la vejiga con unas tijeras oftálmicas y desdóblela con pinzas y un divisor de núcleo de cuchara.
- Enjuague la vejiga en el vaso de precipitados 1 y colóquela en el recipiente de vidrio 2.
- Eliminar la grasa adherida en la superficie del tejido utilizando pinzas y tijeras oftálmicas en un plato de vidrio 2.
- Enjuague la vejiga en el vaso de precipitados 2 y colóquela en el recipiente de vidrio 3.
- Raspe suavemente la vejiga con las pinzas y el divisor de núcleos de la cuchara en el plato de vidrio 3 para eliminar los accesorios exógenos.
- Enjuague la vejiga en vaso de precipitados 3, transfiera la vejiga a un tubo de centrífuga de 15 mL con 14 mL de solución Krebs fría y centrifuga la muestra durante 1 min a 356 x g y 4 °C.
- Repita el paso anterior dos veces en otros dos tubos con solución Krebs para reducir la contaminación.
>3. Digestión de la vejiga en dos pasos
- Transfiera la vejiga del tubo de centrífuga a un vial de 2 mL que contenga 1 mL de solución de digestión 1. Use tijeras oftálmicas para cortar la vejiga en pedazos pequeños (menos de 1 mm) en solución.
- Mezclar la solución vesical con 9 mL de solución de digestión 1 en una placa de cultivo celular estéril (100 mm de diámetro). Realice la digestión del paso 1 en una incubadora de agitación durante 1 h bajo 5% de CO2, 37 °C y 200 rpm.
- Después de la digestión del paso 1, centrifugar la solución a 356 x g a 4 °C durante 8 min.
- Coloque la solución de digestión 2 en un baño de agua a 37 °C para precalentar.
- Después de la centrifugación, retire el sobrenadante que contiene la solución de digestión 1 y recoja el sedimento celular. Se permite algún líquido restante. La eliminación completa de la solución puede promover la pérdida de células.
- Mezcle el sedimento celular con la solución tibia de digestión 2 en un tubo de centrífuga de 15 mL y agite la mezcla mientras la digiere en un baño de agua a 37 °C durante 5 min. No exceda los 7 minutos de la digestión del paso 2, o las neuronas perecerán.
- Después de la digestión, desactive inmediatamente la tripsina en la mezcla con 10 mL de medios de enjuague fríos.
nota: Realice los siguientes pasos entre 0 °C y 4 °C. Un baño de hielo podría proporcionar tales condiciones.
- Recoja el sedimento celular después de la centrifugación a 356 x g a 4 °C durante 8 min. Elimine la mayor cantidad de medio posible porque la tripsina restante daña el crecimiento celular.
- Vuelva a suspender el sedimento con 3 mL de medio neuronal suavemente. Asegúrese de que no se generen burbujas de aire en la solución que contiene las células para una alta tasa de supervivencia.
- Filtre el medio de mezcla a través de un filtro de celdas de 70 μm en un tubo de centrífuga de 50 mL.
- Mantenga el filtrado en un agitador a 30 rpm en un baño de hielo durante 30 min. Este paso no es necesario, pero sí recomendable.
- Recoja las células por centrifugación a 356 x g a 4 °C durante 8 minutos y vuelva a suspender suavemente los gránulos de células en 1 ml de medio neuronal A.
- Agregue 500 μL de mezcla de células en cada pocillo de la placa de 48 pocillos preparada.
- Cultivar células en una incubadora a 37 °C y 5% de CO2.
- Reemplace todos los medios con medios neuronales B en 1 h para proporcionar un cultivo libre de suero.
- Cambie la mitad de la neurona media B cada 3 días.
nota: Las neuronas están listas para los experimentos inmunocitoquímicos después de 5 a 7 días de cultivo.
Tabla 1. Composición de la solución Krebs
| ingredientes | Molaridad (mM) |
| NaCI | 120 |
| Kci | 5.9 |
| NaHCO3 | 25 |
| Na2HPO4·12H2O | 1.2 |
| MgCI2·6H2O | 1.2 |
| CaCI2 | 2.5 |
| glucosa | 11.5 |
