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Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Preparación y recubrimiento de los chips multicompartimento
- En un armario de bioseguridad, coloque el chip en una placa de Petri u otro recipiente estéril adecuado.
- Agregue 100 μL de solución de pre-recubrimiento al pocillo superior izquierdo de la viruta y deje que fluya a través del canal principal hacia el pocillo adyacente.
nota: La solución de pre-recubrimiento se utiliza para pre-recubrir los canales microfluídicos para eliminar la posibilidad de atrapar burbujas de aire dentro del chip.
- Llene el pocillo inferior izquierdo con 100 μL de solución de pre-recubrimiento. Espere 5 minutos para permitir que la solución fluya a través de las microranuras.
- Agregue 100 μL de solución de recubrimiento previo al pocillo superior derecho y deje que fluya a través del canal principal hacia el pocillo contiguo. Llene el pocillo inferior derecho con 100 μL de solución de pre-recubrimiento.
- Aspire la solución de cada pocillo. Aspire lejos de los canales principales para evitar eliminar líquido de los canales principales (Figura 1A). Agregue inmediatamente 150 μL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) al pocillo superior izquierdo. Espere 1.5 min.
cautela: No aspire todo el líquido de los canales principales adjuntos.
- Agregue 150 μL de PBS al pocillo inferior izquierdo. Espere 5 minutos para permitir que los líquidos fluyan a través de las microranuras. Agregue 150 μL de PBS en el pocillo superior derecho. Agregue 150 μL de PBS en el pocillo inferior derecho. Espere 10 min.
- Repita los pasos 1.5-1.6 para un segundo lavado con PBS.
- Revise el chip bajo un microscopio de cultivo de tejidos para ver si hay burbujas en los canales principales. Si hay burbujas, realice los procedimientos que se indican a continuación. Si no hay burbujas, vaya al paso 1.9.
- Aspire el PBS de los pocillos, inclinando la punta de la pipeta lejos de la abertura del canal (Figura 1A).
- Dispense 100 μL de solución de prerrecubrimiento en el pocillo superior, inclinando la punta de la pipeta cerca de la abertura del canal (Figura 1B). Las burbujas deben moverse a través del canal hacia el pozo inferior. Espere 1,5 min.
- Repita los pasos 1.3-1.8.
- Aspire el PBS de los pocillos, inclinando la punta de la pipeta lejos de la abertura del canal (Figura 1A).
- Agregue 100 μL de 0,5 mg/mL de poli d-lisina (PDL) en el pocillo superior izquierdo del chip. Espere 1,5 min. Llene el pocillo inferior izquierdo con 100 μL de PDL.
- Agregue 100 μL de PDL en el pocillo superior derecho del chip. Espere 1,5 min. Añadir 100 μL en el pocillo inferior derecho.
- Cierre la placa de Petri y coloque el chip en una incubadora a 37 °C durante 1 h.
- Repita los pasos de lavado PBS 1.5-1.6 dos veces para eliminar el exceso de PDL.
- Aspire el PBS del dispositivo.
- Añada inmediatamente 100 μL de medio de cultivo celular en el pocillo superior izquierdo del chip. Espere 1,5 min. Agregue medios en el cuadro inferior izquierdo. Agregue medios en el cuadro superior derecho. Espere 1,5 min. Agregue 100 μL de medio en el pocillo inferior derecho del chip.
- Coloque el chip en la incubadora a 37 °C hasta que esté listo para colocar las celdas en placas.
>2. Sembrando neuronas en los chips multicompartimentados
- Prepare la suspensión celular de neuronas disociadas del hipocampo de rata de acuerdo con los protocolos establecidos para producir una densidad de ~ 12 × 106 células / mL.
nota: Es posible el uso de densidades de suspensión celular entre 3 y 12 × 106 células/mL. Si se utiliza una densidad más baja, se puede aumentar el volumen de suspensión de celdas que se agregará al chip. El procedimiento descrito a continuación es aplicable para las neuronas corticales o del hipocampo disociadas murinas. Las densidades celulares óptimas para otros tipos de neuronas pueden variar.
- Retire la mayoría de los medios en cada pocillo del chip, dejando aproximadamente 5 μL en cada pocillo. Aspire lejos de los canales principales para evitar eliminar líquido de los canales principales (Figura 1A).
cautela: No aspire líquido de los canales principales incluidos. Las burbujas de aire pueden quedar atrapadas en el chip si se aspira líquido desde los canales principales.
- Cargue 5 μL de suspensión celular en el pocillo superior derecho y otros 5 μL de suspensión celular en el pocillo inferior derecho (~120,000 celdas en total). Cargue las celdas dispensándolas cerca del canal principal (Figura 1B). Revise bajo un microscopio para asegurarse de que las neuronas estén en el canal principal. Espere 5 minutos para permitir que las celdas se adhieran.
nota: Las neuronas se pueden cargar en cualquiera de los compartimentos. Para fines de explicación, el compartimento somático es el canal principal en el lado derecho, pero cualquiera de los compartimentos se puede usar como compartimento somático. Es posible el uso de densidades de celdas más bajas de hasta 60,000 celdas por chip. Se pueden añadir hasta 10 μL de suspensión celular a cada pocillo del compartimento somático en combinación con una suspensión celular con menos células que las descritas anteriormente.
- Agregue aproximadamente 150 μL de medio de cultivo neuronal a cada uno de los pocillos superior e inferior derecho, y luego agregue 150 μL de medio a cada pocillo superior e inferior izquierdo. Coloque el chip en la bandeja humidificada en una incubadora de 5% CO2 a 37 °C.
- Después de 24 h, realice un cambio de medio retirando el medio de los pocillos. Asegúrese de que el canal principal permanezca lleno. Agregue 150 μL de medio a cada pocillo superior y luego llene los pocillos inferiores.
- Vuelva a colocar el chip en la incubadora durante el número de días deseado.
nota: Monitoree el medio cada pocos días para asegurarse de que permanezca de color rosa claro. Si el medio es amarillento, reemplace el 50% con medio nuevo. Si el nivel del líquido es bajo, asegúrese de que haya una humedad adecuada y una contención secundaria adecuada de las virutas para evitar la evaporación. Es posible minimizar o eliminar los cambios de medios utilizando la contención secundaria y/o cubriendo el plato que contiene el chip con una película de politetrafluoroetileno (PTFE)-FEP.
