Todos los procedimientos relacionados con la recolección de muestras se han realizado de acuerdo con las directrices del IRB del instituto.
1. Preparar soluciones para experimentos
- Prepare la solución de recubrimiento de matriz extracelular (ECM) (consulte la tabla de materiales): Descongele la mezcla de ECM en hielo. Diluir la mezcla de ECM 1:10 en medio de cultivo básico (sin factores neurotróficos ni suero fetal bovino (FBS)) y almacenar en hielo.
- Prepare el medio de cultivo (consulte la tabla de materiales): Prepare un stock de medio neurobasal que no contenga FBS ni factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF). Complemente los medios neurobasales con FBS fresco (10%) y BDNF (5 ng/ml) justo antes de añadirlos al cultivo celular.
- Prepare la solución extracelular (ver Tabla de Materiales).
>2. Lavado y esterilización de MEAs
>NOTA: Los MEAs utilizados para los experimentos contienen 68 electrodos dispuestos en una cuadrícula rectangular (Figura 1E). Cada electrodo tiene un tamaño de 40 x 40 μm2 con un espaciado de 200 μm de centro a centro. Los electrodos están hechos de platino. Los electrodos están conectados a los contactos correspondientes por un circuito hecho de óxido de indio y estaño. Este circuito está aislado por una capa de 5 μm de SU-8. Consulte la tabla de materiales para obtener más información sobre el proveedor. Otros diseños de MEA pueden ser adecuados para estos experimentos.
- Para MEAs nuevos: Enjuáguelos sumergiéndolos en etanol al 70% durante 30 segundos y lávelos con agua destilada durante 30 segundos. Trabaje en una campana de flujo laminar.
- Deje secar el MEA durante 30 minutos en una campana de flujo laminar.
- Coloque cada MEA en una placa de Petri estéril individual (35 mm x 10 mm) y selle con papel de aluminio. Los AMUMA se pueden almacenar hasta que se utilicen.
- Para los MEAs usados: Incubar los MEAs en una placa de Petri (35 mm x 10 mm) que contenga 1 ml de solución enzimática (ver Tabla de Materiales) O/N en un agitador orbital a RT para eliminar el material biológico. A continuación, continúe como en el paso 2.1.
nota: Manipule los MEA con cuidado utilizando pinzas con puntas recubiertas de goma.
>3. Preparación de MEAs para Experimentos de Cultivo
- Retire la lámina de sellado y deje el MEA en la placa de Petri (35 mm x 10 mm) durante todo el experimento.
- Recubrir los MEAs con la solución preparada en 1.1: Utilice una punta de pipeta fría de 200 μl (almacenada a -20 °C) para pipetear 50 μl de solución de recubrimiento a cada MEA, cubriendo toda el área del electrodo.
- Deje que los MEA se cubran durante 30 minutos a 1 hora en RT.
- Retire la solución de recubrimiento con una pipeta. Aplicar 100 μl de medio de cultivo suplementado con 10% de FBS y 5ng/ml de BDNF y dejar actuar en RT hasta la siembra del tejido.
- Coloque 2 placas de Petri que contengan los MEA recubiertos en una placa de Petri grande (94 mm x 16 mm) y agregue una tercera placa de Petri pequeña que contenga 1,5 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) para la humidificación.
nota: La adición de una pequeña placa de Petri (paso 3.5) que contenga PBS es crucial para minimizar significativamente la evaporación del medio de cultivo.
>4. Disección de ganglios en espiral
NOTA: La disección macroscópica se puede realizar fuera de la campana de flujo laminar (Paso 4.1 a 4.4). Para la disección fina, las condiciones estériles (campana de flujo laminar) son obligatorias (a partir del paso 4.5).
- Eutanasia de animales (ratones de 5-7 días de edad) por decapitación sin anestesia previa.
- Esterilizar la cabeza rociándola con etanol al 70%.
- Al sujetar la cabeza, corte la conexión entre la piel y el cráneo con una tijera afilada a lo largo de la línea sagital.
- Corta el cráneo sagitalmente y retira el cerebro con unas tijeras afiladas o romas.
- Corte los huesos temporales del cráneo y colóquelos en una placa de Petri que contenga una solución salina equilibrada de Hanks (HBSS) estéril y helada.
- Con un microscopio de disección, diseccione la bulla timpánica con pinzas finas y aísle el oído interno.
- Retire el hueso de la cóclea con pinzas finas.
- Retire el ligamento espiral y la estría vascular (SV) juntos sosteniendo con pinzas la porción basal del ganglio espiral (SG) y el SV y desenrollando lentamente el SV desde la base hasta el ápice
- Aislar el órgano de Corti (OC), el SG y el modiolo (Figura 1A-C).
- Separe el OC del SG y el modiolo sosteniendo con pinzas la porción basal del SG y el OC y desenrollando lentamente el OC desde la base hasta el ápice.
- Corte explantes laterales (de 200 a 500 μm de diámetro) del ganglio espiral aún adherido al modiolo (Figura 1D) con pinzas y un microbisturí.
5. Cultivo de explantes de ganglios espirales en MEAs
- Colocar dos explantes ganglionares espirales junto a los electrodos sobre el MEA previamente preparado con 100 μl de medio de cultivo.
- Coloque el órgano de Corti a una distancia aproximada de 5 mm de la zona del electrodo.
- Utilice fórceps para fijar los explantes y el órgano de Corti en el MEA evitando dañar el tejido.
- Coloque los MEA con cuidado en la incubadora y cultive a 37 °C y 5% de CO2. Al día siguiente, inspeccione visualmente que los explantes se hayan adherido al MEA.
nota: Si los explantes no han adherido O/N, rara vez lo harán en los próximos días. El OC se coloca adyacente al cultivo para el soporte trófico/neurotrófico.
- Añadir 100 μl de medio de cultivo que contenga un 10% de FBS y BDNF diariamente durante 5 días consecutivos.
- El día 6, agregue 2 ml de medio de cultivo que contenga 10% de FBS y 5 ng/ml de BDNF y cultive el tejido durante 13 días adicionales.
