1. Siembra de astrocitos para reprogramación
NOTA: Los siguientes pasos deben realizarse bajo una cabina de seguridad biológica con un nivel de seguridad 1 (SL1).
- Prepare placas de 24 pocillos con cubreobjetos de vidrio recubiertos de poli-D-lisina de la misma manera que se prepararon anteriormente los matraces de cultivo. Para determinar el número de placas necesarias, considere que los astrocitos se siembran a una densidad de 5-5,5 x 104 células por pocillo en una placa de 24 pocillos. Por lo general, el aislamiento de seis médulas espinales de los ratones del día 2 postnatal (P2) produce alrededor de 1 x 106 células.
- Aspire los medios de los matraces de cultivo T25 que contienen los astrocitos cultivados y lávese una vez con solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1x. Separa los astrocitos del matraz de cultivo añadiendo 0,5 mL de tripsina/ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) al 0,05% e incuba a 37 °C durante 5 min. Golpee suavemente el costado del matraz para liberar las células de la superficie del matraz de cultivo y verifique el desprendimiento bajo un microscopio de campo claro con un aumento de 10X.
- Detenga la tripsinización con 2,5 mL de medio de cultivo de astrocitos y recoja la suspensión celular en tubos de 15 mL. Centrifugar a 300 x g durante 5 min, aspirar el sobrenadante y resuspender las células en 1 mL de medio de cultivo de astrocitos. Calcule la concentración de células utilizando un hemocitómetro o un sistema automatizado de recuento de células.
- En función del número de células, diluya la suspensión celular con medio de astrocitos fresco para obtener una solución de 1-1,1 x 105 células por ml. Complemente el medio con factor de crecimiento epidérmico (EGF) y factor de crecimiento básico de fibroblastos (bFGF) a 10 ng/ml por factor. Añadir 500 μL de suspensión celular, equivalente a 5-5,5 x 104 células, a cada pocillo de las placas de 24 pocillos previamente preparadas y células de cultivo a 37 °C y 5% de CO2.
>2. Expresión forzada de factores de transcripción
NOTA: Antes de continuar con el protocolo, es esencial diseñar correctamente el experimento. En particular, es importante incluir siempre un control negativo para la reprogramación, es decir, una condición en la que no se expresa ningún factor de reprogramación. Por ejemplo, cuando se utilizan vectores que llevan el ADNc para el factor de reprogramación y un reportero (por ejemplo, la proteína verde fluorescente (GFP), DsRed), el control negativo está representado por el mismo vector que lleva solo el reportero. Cuando se expresan múltiples factores portadores de diferentes reporteros, el control negativo debe ajustarse en consecuencia.
- Al día siguiente de la colocación de la placa, inspeccione las placas de 24 pocillos para asegurarse de que las células se hayan adherido a los cubreobjetos.
- Con base en el objetivo experimental y los recursos disponibles, la expresión forzada de los factores de reprogramación se puede lograr mediante transducción viral (ver paso 2.3) o transfección de ADN (ver paso 2.4).
NOTA: El uso de retrovirus o lentivirus requiere la aprobación de las autoridades gubernamentales y debe realizarse bajo un gabinete de seguridad biológica dentro de un laboratorio con nivel de seguridad 2 (SL2).
- Reprograme los astrocitos transduciendo las células con el retrovirus o lentivirus que lleva la información genética para expresar los factores de reprogramación de interés, como se describe a continuación.
- Transducir células con un alto título de virus de 1 x10 10-1 x10 12 partículas/mL añadiendo 1 μL de la suspensión celular directamente al medio de astrocitos. Esto asegura una alta tasa de infección. Cultivar las células con el medio de astrocitos que contiene partículas virales a 37 °C durante 24-36 h antes de continuar con la sección 3, dependiendo del propósito del experimento><.
NOTA: Se pueden utilizar diferentes promotores para impulsar la expresión de los transgenes (ver también Resultados representativos). Los promotores constitutivos {por ejemplo, citomegalovirus (CMV), β-actina de pollo (CAG)} inducen la expresión del transgén antes que los promotores inducibles; Sin embargo, ambos tipos de promotores se han utilizado con éxito para reprogramar células en neuronas.
- Los plásmidos de ADN también pueden introducirse en los astrocitos a través de la transfección de ADN, como se describe a continuación
nota: Esto se puede hacer bajo una cabina de seguridad biológica aprobada para SL1.
- Antes de la transfección, obtenga el reactivo de transfección, un ADN plásmido de las construcciones deseadas, medio de astrocitos fresco y medio reducido en suero (consulte la tabla de materiales). Calcule la cantidad requerida de medio reducido en suero (consulte la Tabla de materiales) considerando que cada pocillo de una placa de 24 pocillos requiere 300 μL de medio reducido en suero. Añadir la cantidad adecuada de medio sérico reducido en un tubo de 50 ml y calentarlo a 37 °C.
- Cuando el medio reducido en suero esté tibio, aspire el medio de astrocitos de todos los pocillos y recójalo en un tubo de 50 mL. Filtre el medio de astrocitos recolectado con un filtro de jeringa de 0,45 μM para eliminar las células desprendidas.
- Agregue un volumen igual de medio de astrocitos fresco al medio filtrado para obtener una solución suficiente para agregar 1 mL de medio de astrocitos por pocillo. Mantener el medio acondicionado con astrocitos en la incubadora a 37 °C hasta su uso (paso 2.4.9).
nota: El medio de cultivo se reutiliza ya que contiene varios factores secretados que apoyan la viabilidad del cultivo.
- Agregue 300 μL de medio precalentado con suero reducido a cada pocillo y vuelva a colocar la placa de 24 pocillos en la incubadora.
- Prepare la solución A, que consiste en ADN y medio reducido en suero. Para cada pocillo, use un total de 0,6 μg de ADN y agréguelo a 50 μL de medio reducido en suero. Almacene la solución A a temperatura ambiente hasta su uso.
NOTA: Por lo general, se considera un triplicado técnico por condición. Por lo tanto, se prepara una mezcla suficiente para la reacción 3,5 (por ejemplo, 2,1 μg de ADN total diluido en 175 μL de medio reducido en suero) para asegurar suficiente material para transfectar tres pocillos de una placa de 24 pocillos.
- Prepare la solución B, compuesta por el reactivo de transfección y el medio sérico reducido. Para cada pocillo, agregue 0,75 μL de reactivo de transfección a 50 μL de medio sérico reducido. Como esta solución es común a todas las condiciones de transfección, prepárela a granel para reducir la variabilidad entre las transfecciones.
- Incubar la solución B a temperatura ambiente durante 5 min. Añadir la solución B a la solución A gota a gota en una proporción de 1:1 y mezclar suavemente. No haga vórtice. Incubar la solución A+B durante 20-30 min a temperatura ambiente bajo el capó.
- Repita los pasos 2.4.5-2.4.7 para todas las condiciones de transfección. Después de 20-30 min, añadir la solución A+B a cada pocillo gota a gota hasta obtener un volumen final de 100 μL. Agitar suavemente la placa y volver a colocar las células en la incubadora a 37 °C durante 4 h.
- Después de 4 h, retire el medio de transfección y agregue 1 mL del medio acondicionado de astrocitos precalentado preparado en el paso 2.4.3. Mantenga las celdas durante 36-48 h antes de continuar con la sección 3, dependiendo del propósito del experimento.
>3. Reprogramación de astrocitos (análisis de 7 días)
- Prepare el medio de diferenciación neuronal añadiendo 1 mL de suplemento de B27 a 49 mL de medio de cultivo básico. Después de 24-48 h, dependiendo de si las células han sido transducidas o transfectadas (ver pasos 2.3 y 2.4, respectivamente), reemplace el medio de astrocitos con 1 mL de medio de diferenciación neuronal por pocillo y cultive las células a 37 °C y 9% CO2.
NOTA: Las células también se pueden mantener con un 5% de CO2 si no se dispone de una incubadora con 9% de CO2. Sin embargo, la reprogramación neuronal es más eficiente en estas condiciones.
- Opcional: Para aumentar la eficiencia de reprogramación, complemente el medio de diferenciación neuronal con forskolina (concentración final de 30 μM) y dorsomorfina (concentración final de 1 μM) cuando reemplace el medio de astrocitos por medio de diferenciación. Cuando opte por tratar las células con forskolina y dorsomorfina, proporcione una segunda dosis de dorsomorfina 2 días después del tratamiento inicial. Añadir este segundo tratamiento directamente al medio de cultivo.
- La reprogramación directa de los astrocitos murinos en células neuronales normalmente ocurre dentro de los 7 días posteriores al cambio del medio (Figura 1). Por lo tanto, 7 días después del inicio de la reprogramación neuronal, fije o recoja las células para el análisis posterior.
