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Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Extracción del cerebro con raíz del nervio auditivo intacta para la estimulación
NOTA: Los ratones para estos experimentos se obtuvieron cruzando ratones transgénicos ChAT-IRES-Cre sobre un fondo C57BL/6J con ratones reporteros tdTomato (Ai14). Los ratones utilizados para la histología y la electrofisiología fueron de inicio posterior a la audición (P14-P23), que es alrededor de P12 en ratones. Las neuronas que expresan tdTomato en el núcleo ventral del cuerpo trapezoidal (VNTB) se han caracterizado previamente como neuronas olivocochleares mediales (MOC) en esta línea de ratones.
- Eutanasia (por ejemplo, asfixia con CO2) y decapitar al animal utilizando procedimientos institucionales aprobados.
- Con una cuchilla de afeitar, corta la piel en la línea media del cráneo desde la nariz hasta la parte posterior del cuello. Retira la piel para exponer el cráneo.
- Con unas tijeras pequeñas, haga una incisión en el cráneo a través de la línea media, comenzando en la base (extremo caudal cerca de la médula espinal) del cráneo y continuando hacia la nariz.
- En la sutura lambda, haga cortes en el cráneo desde la línea media, lateralmente hacia la oreja en ambos lados. Retira el cráneo para exponer el cerebro.
- Comenzando por el extremo rostral, levante suavemente el cerebro del cráneo con una pequeña espátula de laboratorio o pinzas romas. Corte el nervio óptico y continúe trabajando suavemente el cerebro hacia atrás, exponiendo la superficie ventral.
- Cortar los nervios trigéminos pellizcándolos con pinzas finas cerca de la superficie ventral del tronco encefálico.
nota: Haga esto con cuidado, ya que el nervio vestibulococlear se encuentra justo debajo de este y debe estar intacto para una eventual estimulación.
- Coloque la preparación en una placa de Petri de vidrio llena de solución fría para cortar. Coloque el plato bajo un microscopio de disección. Burbujee suavemente con cárbogo.
- Recortar el nervio facial cerca del tronco encefálico y exponer el nervio vestibulococlear.
- Con pinzas finas, empuje las puntas hacia los agujeros donde el nervio vestibulococlear sale del cráneo lo más lejos posible y apriete el nervio para cortarlo, dejando la raíz nerviosa unida al tronco encefálico. Repita esto en el otro lado.
- Una vez que ambas raíces nerviosas estén libres, retire las meninges y la vasculatura de la superficie ventral del tronco encefálico cerca del cuerpo trapezoidal.
- Libere el cerebro completamente del cráneo pellizcando los nervios craneales restantes y el tejido conectivo, teniendo cuidado de preservar la médula espinal restante si es posible.
>2. Bloquear y montar el cerebro en el escenario (disco magnético)
- Preparar la superficie del cerebro para que se fije a la etapa bloqueando el cerebro a nivel del quiasma óptico.
- Con la superficie ventral hacia arriba, estabilice el cerebro con una herramienta roma para inmovilizar suavemente la médula espinal de modo que el cerebro no se incline durante el siguiente paso.
- A nivel del quiasma óptico, use pinzas abiertas para crear el plano para bloquear el cerebro insertándolo a través del cerebro hasta el fondo del plato. Inserte las pinzas en un ángulo de aproximadamente 20° con respecto a la vertical para que las puntas salgan de la superficie dorsal del cerebro caudal hasta el quiasma óptico.
- Corta a lo largo de las pinzas con la cuchilla de afeitar.
- Pega el cerebro a la superficie del escenario.
- Prepare un pequeño bloque (~ 1 cm3) de agar al 4% para apoyar el cerebro.
- Coloque una pequeña gota de pegamento en el escenario y extiéndala en un rectángulo para que tanto el cerebro como el bloque de agar se puedan pegar.
- Con unas pinzas, levante con cuidado el cerebro y frote suavemente el exceso de líquido con el borde de una toalla de papel. Coloque la superficie bloqueada sobre el pegamento, la superficie ventral estará hacia la cuchilla durante el corte.
- Empuje el bloque de agar suavemente contra la superficie dorsal del cerebro para sostenerlo durante el corte y para asegurar la posición adecuada del cerebro (es decir, el ángulo).
>3. Cortar el cerebro para crear una rebanada en cuña
>NOTA: Prepare un corte de cerebro utilizando un vibratomo que tenga la raíz del nervio coclear en el lado grueso y las neuronas olivococleares mediales (MOC) y el núcleo medial del cuerpo trapezoidal (MNTB) en el lado delgado.
- Coloque el disco magnético con el cerebro adjunto en la base del escenario y colóquelo en la cámara de corte con la superficie ventral del cerebro orientada hacia la cuchilla.
- Llene la cámara con una solución de corte helada y burbujee con carbógeno.
- Baje la cuchilla en la solución y corte las rodajas caudalmente a la región de interés para asegurarse de que las rodajas sean simétricas. Si los cortes parecen asimétricos, incline ligeramente la platina para obtener simetría.
nota: Las velocidades de la cuchilla entre 0,05 y 0,10 mm/s fueron efectivas para cortar lonchas sanas y pueden variar según la edad del animal y la región del cerebro.
- Una vez que las rebanadas estén simétricas, desplace la platina ~15° (correspondiente a aproximadamente 3 anillos concéntricos en la base de la platina) hacia un lado.
nota: Aleje la etapa de la raíz del nervio auditivo que desea conservar en la rebanada.
- Continúe cortando con cuidado hasta que la raíz del nervio auditivo esté cerca de la superficie en un lado y el nervio facial se pueda ver en la superficie del otro lado.
- Retroceda la platina 15° a la posición original.
- Aleje la hoja del pañuelo y gire la base de la platina 90° para que el borde lateral del lado delgado quede hacia la hoja. Baje la cuchilla varios cientos de micras y luego acerque lentamente la cuchilla al borde del tejido. Repita esto hasta que la hoja toque el borde lateral. Baje la cuchilla hasta el grosor deseado del borde delgado de la rebanada, aquí doscientas micras adicionales.
nota: El corte resultante tiene idealmente ~300 mm de grosor a nivel del núcleo ventral del cuerpo trapezoidal (VNTB) en el lado donde se realizará la sujeción del parche.
- Mueva la cuchilla hacia atrás lejos del tejido y gire la base de la platina hacia atrás para que la superficie ventral quede frente a ella.
- Haga el corte que designa la superficie rostral de la rebanada en cuña. Transfiera la rebanada a un trozo de papel de interfaz (1 cm2) con la superficie caudal hacia abajo. Traslado del corte a la cámara de incubación o a otro aparato de incubación adecuado para la recuperación (30 min a 35 °C).
nota: El nervio facial debe ser visible en ambos hemisferios de la rebanada en la superficie rostral (véase la figura 1B).
