Estimulación de la diferenciación de células neuronales mediante nanovarillas de oro

Resumen

Fuente: Paviolo., et al. Estimulación óptica asistida por nanovarillas de oro de células neuronales. J. Vis. Exp. (2015).

Este video muestra una técnica para promover la diferenciación neuronal mediante la exposición de las células nerviosas a nanovarillas de oro y luz láser, que forma proyecciones celulares apoyadas por la βIII-tubulina. La tinción y observación de la tubulina y el núcleo celular con microscopía de epifluorescencia revela las excrecencias celulares, lo que indica la eficacia de las nanovarillas en la diferenciación neuronal.

Protocolo

1. NG108-15 Cultivo y diferenciación de líneas celulares neuronales

1. Para el medio de cultivo celular, prepare 500 ml de medio Eagle modificado (DMEM) estéril de Dulbecco que contenga un 10% (p/v) de suero fetal de ternero (FCS), un 1% (p/v) de L-glutamina, un 1% (p/v) de penicilina/estreptomicina y un 0,5% (p/v) de anfotericina B.
   Nota: Los suplementos pueden ser alícuotas, almacenados a -20 °C y añadidos a los medios en el día requerido. El medio de cultivo celular se puede refrigerar en condiciones estériles durante un máximo de 1 mes.
2. Para el medio de diferenciación celular, prepare 50 ml de DMEM estéril que contenga L-glutamina al 1% (p/v), penicilina/estreptomicina al 1% (p/v) y anfotericina B al 0,5% (p/v).
3. Cultivar células neuronales NG108-15 en 10 ml de medio de cultivo celular en matraces T75 de poliestireno en una incubadora con atmósfera humidificada (5% de CO2 a 37 °C). Normalmente, siembre 1,5-2 × 10⁵ celdas en cada matraz para que esté listo en 3-4 días. Cambie el medio de cultivo celular cada dos días.
   Nota: Para evitar derivas o variaciones genéticas, no utilice células anteriores al pasaje 21 para los experimentos.
4. Cuando el 70-80% confluya en el cultivo, cambie el medio por un medio de cultivo celular fresco y tibio. Separe mecánicamente las células golpeando suavemente el fondo del matraz confluente. No use tripsina.
5. Centrifugar la suspensión celular durante 5 min a 600 x g y volver a suspender el pellet celular en 2 ml de medio de diferenciación celular caliente.
6. Semilla 2 × 10⁴ células/^cm2 en una placa de poliestireno de 96 pocillos de cultivo de tejidos con 200 μl de medio de diferenciación celular. Incubar el experimento durante 1 día a 5% de CO2 / 37 °C.
7. Añadir entre 3,2 × 10⁹ - 4,2 ×^{10 10} partículas/ml de solución de nanovarilla de oro (Au NR) el día 2 e incubar durante 24 horas más. No agregue las partículas para los experimentos de control.
   Nota: Como control alternativo, se pueden utilizar nanopartículas de oro (Au NP) con una longitud de onda de absorción máxima bien diferenciada con fines de comparación, para un comportamiento celular más consistente, mantenga constante la densidad celular y no modifique la superficie del pozo antes de la siembra celular.

>2. Mejora del crecimiento de las neuritas

1. Acople el láser con una fibra óptica monomodo (apertura numérica = 0,13) y termínelo con un conector de fibra (los conectores FC son convenientes y comúnmente disponibles). Mida la potencia del láser de salida con un medidor de potencia estándar. Para obtener los resultados más efectivos, haga coincidir la longitud de onda máxima del láser con el pico de resonancia de plasmón de los NR.
2. El día 3 después de la incubación NR, fije el conector FC al pocillo. Irradie muestras y controles en RT durante 1 minuto en onda continua para diferentes potencias de láser. Deje que el cultivo continúe durante 3 días adicionales al 5% de CO2 / 37 °C. Repita la irradiación láser para un mínimo de 3 mediciones independientes.
   Nota: Se pueden seleccionar diferentes tiempos de irradiación y frecuencias de pulso dependiendo de la aplicación.
3. Caracterizar el láser en términos de diámetro del haz e irradiancia del láser (W∙cm-2).
   1. Para una fibra monomodo estándar, use NA = n∙sinθ, donde n es el índice de refracción del medio en uso y θ es el semiángulo del cono de luz que sale de la fibra (consulte la Figura 1A). De trigonometría, r = tanθ∙d, donde r es el radio del haz y d es la distancia entre la fibra y la muestra. El conector FC coincide con el diámetro del pocillo, por lo que ilumina la muestra a una distancia d = 2,70 ± 0,20 mm. La luz sale de la fibra en el agua (n = 1.33), dando r = tan(sin-1(NA/n))∙d.
   2. Usando la última ecuación, calcule el radio del rayo láser, el área del haz correspondiente y la irradiancia láser promedio (potencia del láser dividida por el área del haz) en el objetivo (vea el gráfico de ejemplo en la Figura 1B). Estos valores representan la irradiancia media sobre el área iluminada.
   3. Evalúe los errores para las mediciones con la teoría general de la propagación de errores.
      Nota: La distancia entre el conector FC y la muestra puede medirse mediante fotografías de la disposición experimental y el procesamiento posterior de la imagen utilizando el software adecuado (por ejemplo, ImageJ).
4. En el día 5, retire el medio de diferenciación celular de los experimentos y fije las muestras con una solución de formaldehído al 3,7% (v/v) durante 10 min, luego permeabilice las células con Triton X-100 al 0,1% (v/v) durante 20 min.
5. Añadir un 3% (p/v) de albúmina sérica bovina (BSA) a las muestras durante 60 min para bloquear los sitios de unión a proteínas no reaccionados. Etiquete las muestras de anti-βIII-tubulina durante la noche (5 μg/ml en PBS suplementado con 1% de BSA) a 4 °C.
6. Incubar las células durante 90 minutos en la oscuridad con un anticuerpo secundario apropiado (por ejemplo, anticuerpo IgG anti-ratón conjugado con TRITC (tetrametilrodamina)) utilizando una concentración de 0,4-2 μg/ml en BSA al 1% en PBS. Etiquete los núcleos celulares con DAPI (4′,6-diamidino-2-fenilindol) (0,1 μg/ml en agua desionizada) durante 10 min.
   Nota: La conjugación y la concentración de anticuerpos pueden variar según el protocolo de la empresa. Lave las muestras con PBS dos veces durante 5 minutos después de cada etapa de tinción.
7. Imágenes de muestras por epifluorescencia o microscopía confocal utilizando un objetivo de al menos el 20×. Elija los filtros del microscopio de acuerdo con el anticuerpo secundario. Seleccione un filtro DAPI (λEX = 358 nm; λEM = 488 nm) para visualizar los núcleos de la célula.
8. Analice las imágenes evaluando: i) la longitud máxima de la neurita (registre la longitud desde la punta de la neurita hasta el comienzo del cuerpo celular), ii) el número de neuritas por célula neuronal (sume todas las neuritas por célula) y iii) el porcentaje de células con neuritas (divida el número total de células que expresan βIII-tubulina por el número total de células con un núcleo teñido positivamente)

Resultados

Figura 1. La configuración experimental de fibra óptica (A) y las radiancias láser promedio en función de la potencia del láser para un rayo láser de área es igual a 0,4 mm2 (B). Los parámetros del haz son (A): el semiángulo del cono máximo de luz que sale de la fibra (θ), el radio del haz (r) y la distancia entre la fibra óptica y la muestra (d).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Au NR	Sigma Aldrich	716812
NG108-15	Sigma Aldrich	8811230
DMEM	Sigma Aldrich	D6546
Fcs	Tecnologías de la Vida	10100147
L-glutamina	Sigma Aldrich	G7513
Penicilina/estreptomicina	Tecnologías de la Vida	15140122
Anfotericina B	Tecnologías de la Vida	15290018
Formaldehído	Sigma Aldrich	F8775
Tritón X-100	BDH	T8532
Bsa	Sigma Aldrich	A2058
Anti-βIII-tubulina	Promega	G7121
Anticuerpo IgG anti-ratón conjugado con TRITC	Sigma Aldrich	T5393
DAPI	Invitrogen	D1306
Espectrómetro UV-Vis	Varian Medical Systems Inc.	Cary 50 Bio
Mini centrífuga	Eppendorf	Mini Giro
Baño sónico	Unisonics Australia	FPX 10D
Incubadora de cultivos celulares	Kendro	Celda Hera 150
Centrífuga de cultivo celular	Hettich	Rotofix 32A
Diodo láser	Optotech	Fibra monomodo de 780 nm - LD acoplada
Fibra óptica	Thorlabs	780 CV
Medidor de potencia	coherente	Comprobación láser
ImagenJ	http://rsb.info.nih.gov/ij/index.html
Microscopio epifluorescente	Instrumentos Axon	ImageX-press 5000A
Pbs
Placa de poliestireno de 96 pocillos
CO2
Frascos T75