Generación de cultivos primarios de ganglios angulares de la retina a partir de embriones de pez cebra

Resumen

Fuente: Terzi, A., et al., ROS Imágenes de células vivas durante el desarrollo neuronal. J. Vis. Exp. (2021)

El video muestra un método para cultivar células ganglionares primarias de la retina de embriones de pez cebra. Los embriones en etapa temprana se someten a disección para aislar los ojos, que posteriormente se disocian mecánicamente en una suspensión de células ganglionares de la retina. Esta suspensión celular se cultiva en cubreobjetos recubiertos con proteínas adhesivas para facilitar el desarrollo de los axones.

Protocolo

1. Preparación de soluciones

1. Medios E2 (1x)
   1. Prepare soluciones 100x E2A (500 mL), 500x E2B (100 mL) y 500x E2C (100 mL) combinando todos los componentes que se muestran en la Tabla 1. Soluciones de autoclave E2A, E2B y E2C. Conservar a 4 °C.
   2. Para 1 medio E2: combine 5 ml de 100x E2A, 1 mL de 500x E2B y 1 mL de 500x E2C. Lleve el volumen a 500 mL con agua estéril. Ajusta el pH a 7.0-7.5.
   3. Prepare 50 ml de alícuotas de 1x E2 y almacene a -20 °C para su almacenamiento a largo plazo. Sin embargo, pueden producirse precipitaciones al descongelarse. Asegúrese de que la precipitación se haya disuelto por completo antes de usar la solución madre.

Tabla 1: Componentes de 1x medio E2 para el cultivo celular de pez cebra.

solución	componente	importe	concentración
100X E2A (500 ml)
	NaCl	43,8 g	1500 mM
	Kcl	1,88 g	50 mM
	MgSO4	6 g	100 mM
	KH2PO4	1,03 g	15 mM
	Na2HPO4	0,34 g	5 mM
500X E2B (100 mL)
	CaCl2	5,5 g	500 mM
500X E2C (100 mL)
	NaHCO3	3 g	350 mM
1X E2 (500 mL)
	100X E2A	5 mL	1X
	500X E2B	1 mL	1X
	500X E2C	1 mL	1X

2. Medios E3 (1x)
   1. Disuelva los componentes en 1 L de agua estéril como se muestra en la Tabla 2 para hacer 100 veces el caldo. Diluya el caldo en agua estéril para hacer 1x medio E3.
   2. Añade un 0,2% de azul de metileno. Para 20 ml de 1x medio E3, agregue 40 μl de azul de metileno.

Tabla 2: Componentes de 100x medios E3 para el mantenimiento de embriones de pez cebra.

componente	Cantidad (g)	Concentración en stock 100X (mM)
NaCl	29.22	500
Kcl	1.26	17
CaCl2 2H2O	4.85	33
MgSO4 7H2O	8.13	33

3. 80x solución salina
   1. Combine todos los componentes que se muestran en la Tabla 3. Agregue agua para hacer 100 ml de solución. Mezclar hasta que todos los componentes se disuelvan. Almacene la solución a 4 °C.

Tabla 3: Componentes de la solución salina 80x para medios de cultivo celular de pez cebra.

componente	Cantidad (g)	Concentración en stock (mM)
glucosa	1.44	80
Piruvato de sodio	0.44	40
CaCl2 2H2O	0.148	10
HEPES	6.1	Artículo 256

4. Medio de cultivo celular de pez cebra (ZFCM+)
   1. Combine todos los componentes que se muestran en la Tabla 4 para producir medios de 250 ml. Ajusta el pH a 7,5. Filtre el medio con un filtro de 0,22 μm y guárdelo a 4 °C.

Tabla 4: Componentes del medio de cultivo celular de pez cebra con suero y antibióticos.

componente	Cantidad (mL)	Volumen %
L-15 medio (con rojo fenol)	212.75	Artículo 85.1
Suero fetal bovino (FBS)	5	número arábigo
Penicilina/Estreptomicina	1	0.4
Solución salina 80X	3.125	1.25
Agua	28.125	11.25

>2. Cultivo primario de células ganglionares de la retina derivadas de embriones de pez cebra

NOTA: Realice los pasos 2.1 y 2.2 en una campana de flujo laminar.

1. Preparación de cubreobjetos
   1. Prepare de 4 a 6 placas de cultivo en cada experimento. Utilice cubreobjetos limpios con ácido (cuadrados de 22 x 22 mm; 0,16-0,19 mm de grosor) que se almacenan en etanol 100%.
   2. Retire un cubreobjetos del recipiente de almacenamiento con pinzas y pámelo para eliminar el etanol residual.
   3. Seque completamente el cubreobjetos al aire colocándolo en ángulo dentro de una placa de cultivo de 35 mm.
   4. Prepare la solución de trabajo de poli-D-lisina (PDL) (1x) diluyendo 10x caldo (5 mg/mL) en agua estéril.
   5. Aplique 100 μL de 0,5 mg/mL de PDL en el centro de cada cubreobjetos y evite que la solución se extienda a los bordes.
   6. Incubar la PDL en cubreobjetos durante 20-30 min a temperatura ambiente (RT). Asegúrese de que la PDL no se seque.
   7. Lave la PDL con 0,5 ml de agua estéril tres veces. Deja que los platos se sequen por completo.
   8. Prepare la solución de trabajo de laminina (1x) diluyendo 50x stock (1 mg/mL) en 1x PBS.
   9. Aplique 100 μL de laminina de 20 μg/mL en PBS en el centro de cada cubreobjetos y evite que la solución se extienda a los bordes.
   10. Incubar las placas a 37 °C en una incubadora humidificada durante 2-6 h. Evite secar la solución de laminina.
2. Disección de embriones y siembra de RGC
   1. Prepare y etiquete cuatro placas de cultivo de tejidos de 35 mm y llénelas con 4 mL de: etanol al 70%, "E2 media 1", "E2 media 2", "E2 media 3" el día de la disección. Mantenga los platos en el refrigerador hasta las disecciones.
   2. Cuando los embriones de pez cebra hayan pasado 34 horas desde la fertilización (hpf), saque las placas de cultivo recubiertas con laminina de la incubadora y lave los cubreobjetos tres veces con 0,5 mL de 1x PBS.
   3. Después del lavado final, agregue 4 mL de medio ZFCM(+) a cada placa de cultivo y evite secar la placa.
   4. Recupere los platos de cultivo preparados del paso 2.2.1. Deja que se equilibren a RT.
   5. Llene de 4 a 6 tubos de PCR con 15 μL de medio ZFCM(+). Se necesita un tubo para preparar los RGC de 4 ojos que se colocarán en un cubreobjetos.
   6. Recupere los embriones de pez cebra de la incubadora y sumérjalos en una placa de cultivo de tejidos de 35 mm que contenga etanol al 70% durante 5-10 s para esterilizarlos.
   7. Con una pipeta de transferencia, transfiera los embriones a 1 placa E2 Media que contenga medios E2 estériles para lavar el exceso de etanol.
   8. Transfiera los embriones a la placa E2 Media 2 y retire sus coriones con pinzas afiladas.
   9. Transfiera los embriones a la placa final E2 Media 3 para realizar disecciones.
   10. Con un par de pinzas finas, disecciona las retinas.
   11. Coloque y sujete los embriones antes de su yema con una de las pinzas y retire la cola posterior al saco vitelino con las otras pinzas.
   12. Agarre el cuello con pinzas y retire la cabeza para exponer el cerebro y los ojos a los medios E2. Evite cortar el saco vitelino.
   13. Con la punta de unas pinzas finas, aparta suavemente los ojos de la cabeza, mientras sujetas el tejido craneal con la segunda pinza. Mantenga los ojos aislados de los restos de tejido adyacentes.
   14. Transfiera cuatro ojos a uno de los tubos previamente preparados que contienen ZFCM(+).
   15. Ajuste suavemente hacia arriba y hacia abajo con la pipeta P20 y una punta amarilla unas 45 veces para disociar las células. Evite las burbujas de aire.
   16. Transfiera el ZFCM(+) con celdas disociadas al centro del cubreobjetos. Repita los pasos 10 a 12 para cubrir cubreobjetos adicionales.
   17. Mantenga los cultivos en la mesa de trabajo a 22 °C sobre una rejilla de espuma de poliestireno para absorber las vibraciones.
   18. Realice la obtención de imágenes de 6 a 24 horas después del enchapado.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Placa de cultivo de 35 mm	Sarstedt	83-3900
Cloruro de calcio dihidratado	Fisher Científico	C79-500
Cubreobjetos	Corning	Artículo 2850-22
Placas de Petri desechables (100 x 15 mm)	VWR	25384-094
Suero Fetal Bovino	ThermoFisher Scientific	26140087
glucosa	Sigma Aldich	G7528
HEPES	Sigma Aldich	H4034
Laminina	ThermoFisher Scientific	23017-015
Leibovitz's L-15 Medium sin rojo fenol	Gibco/Fisher Scientific	21-083-027
Pbs	Hyclone/Fisher Scientific	SH3025601
Penicilina/estreptomicina	ThermoFisher Scientific	15140122
Poli-D-lisina (PDL)	Sigma Aldich	P7280
Piruvato de sodio	Sigma Aldich	P5280
Filtro Steritop de 0,22 μm	Millipore	S2GPT05RE