Se obtuvieron aprobaciones éticas al realizar los experimentos.
1. Aislamiento de células mononucleares de sangre periférica humana (PBMNCs)
- Asegurar que todos los donantes firmen el consentimiento informado antes de la extracción de sangre de acuerdo con las directrices institucionales.
- Tome 30 mL de sangre de donantes sanos por personal médico capacitado de acuerdo con el protocolo estándar.
- Aísle los PBMNC por medios de gradiente de densidad. Utilice 10 mL de medio con 25 mL de sangre 1:1 diluida con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y centrifugue a 300 x g durante 30 min.
- Aísle la capa de interfase entre el plasma y el medio de gradiente de densidad mediante pipeteo. Lavar las células aisladas con 5 mL de PBS estéril y centrifugar a 300 x g durante 10 min. Repetir dos veces.
- Cuente el número de celdas mediante métodos estándar utilizando una cámara de conteo.
2. Activación de la glicoproteína anclada al glicosilfosfatidilinositol humano (GPI) mediante reticulación de anticuerpos en la superficie de las PBMNC
- Coloque las células mononucleares (MNC) 6 x 106 en tubos de 15 mL y realice la reticulación de anticuerpos incubando las células con un anticuerpo específico de proteína de membrana humano ligado a GPI (30 μg/mL) durante 30 min en PBS con albúmina sérica bovina (BSA) al 1% a 37 °C.
- Reemplace el medio de incubación con el medio Dulbecco modificado de Iscove suplementado con un 10% de suero fetal bovino (FBS).
- Cultive las células en tubos de poliestireno de 15 mL, coloque los tubos en una incubadora a 37 °C y 5% de CO2 durante 8-10 días (sin agitar). El día 5 (D5), agregue 1-2 mL adicionales de medio de Iscove suplementado con 10% de FBS a cada tubo de 15 mL.
>3. Clasificación de celdas desdiferenciadas recién generadas
- Cuente las células con un contador de células automatizado (18 μL de suspensión celular + 2 μL de colorante de fluorescencia) o en una cámara de recuento.
- Centrifugar la suspensión celular cultivada (5-7 x 10,6) a 300 x g durante 10 min y aspirar el sobrenadante resultante con una pipeta Pasteur estéril.
- Vuelva a suspender el pellet de celda en 90 μL de PBS preenfriado pH 7,2, 0,5% de BSA y 2 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA).
- Añada perlas magnéticas de tamaño nanométrico CD45 positivo (80 μL) a la suspensión celular e incube en hielo durante 15 min.
- Lave las células añadiendo 2 mL de tampón PBS y centrifugue a 300 x g durante 10 min.
- Vuelva a suspender las células en 500 μL de tampón PBS.
- Lave la columna con 500 μL de tampón PBS preenfriado y colóquela en el campo magnético.
- Coloque la suspensión de celdas en la columna y lávela con 500 μL de tampón PBS (dos veces) y el flujo de centrífuga que contiene celdas CD45 negativas. Recógelos en el medio de Iscove suplementado con un 1% de BSA.
- Cuente las celdas en la cámara de conteo.
>4. Preparación de placas de cultivo celular para la diferenciación neuronal de células madre recién generadas
- Cubra los recipientes de cultivo con poli-L-ornitina y laminina para el crecimiento de células neuronales.
- Coloque los cubreobjetos de vidrio en placas de 4 pocillos y cúbralos con poli-L-ornitina diluida 1:5 (0,1 mg/mL en agua bidestilada [ddH2O]) en ddH2O. Coloque los cubreobjetos en una incubadora a 37 °C durante 1 h. A continuación, lavar con ddH2O.
- Descongele lentamente la laminina (0.5-2.0 mg/mL) y agréguela a la parte superior de los cubreobjetos. Incubar a 37 °C durante 2 h.
- Prepare un medio de inducción neural N2 compuesto por 49 mL de la mezcla de medio/nutriente Eagle modificado F-12 (D-MEM/F12) de Dulbecco, 500 μL de suplemento de N2, 400 μL de aminoácidos no esenciales (NEAA), solución básica de factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) a una concentración final de 20 ng/mL (preparada a partir de una solución madre de 100 μg/mL) y heparina a una concentración final de 2 ng/mL.
- Eliminar el exceso de laminina pipeteando y añadir medio neuronal N2 a las placas de cultivo.
>5. Cultivo de células sanguíneas neuronales desdiferenciadas
- Cultivo de células CD45 negativas derivadas de BD en cubreobjetos de vidrio recubiertos de laminina/ornitina durante 2 días en una incubadora a 37 °C y 5% de CO2 en medio N2 para iniciar una diferenciación neuronal de las células recién generadas por BD.
- Cultivo adicional de células en un medio de diferenciación neuronal que consta de 48 mL de medio neurobasal, 500 μL de L-glutamina, 1 mL de B27 Supplement, 500 μL de NEAA, 50 μL de factor neurotrófico recombinante derivado de la glía humana (GDNF) a 5 μg/250 μL en PBS/0,1% BSA, y 50 μL de factor neurotrófico derivado del cerebro humano recombinante (BDNF) a 5 μg/200 μL en PBS/0,1% BSA y 50 μL μL de solución de ácido ascórbico 2,9 g/50 mL en PBS. Coloque las placas en una incubadora a 37 °C y 5% de CO2.
