1. Absorción de nanopartículas magnéticas celulares (MNP)
- Prepare el medio de crecimiento básico para el cultivo de células PC12 agregando 10 % de suero de caballo (HS), 5 % de suero fetal bovino (FBS), 1 % de L-glutamina, 1 % de penicilina/estreptomicina y 0,2 % de anfotericina al medio del Roswell Park Medical Institute (RPMI) y filtre con un filtro de nailon de 0,22 μm.
- Agregue 1% de suero de caballo (HS), 1% de L-glutamina, 1% de penicilina/estreptomicina y 0,2% de anfotericina al medio RPMI para preparar el medio de diferenciación PC12 y filtre con un filtro de nailon de 0,22 μm.
- Cultive las células en un matraz de cultivo no tratado con 10 mL de medio de crecimiento básico; agregue 10 mL de medio de crecimiento básico al matraz cada 2-3 días, y subcultive las células después de 8 días.
- Para la absorción celular, centrifugue la suspensión celular en un tubo de centrífuga durante 8 minutos a 200 × g y temperatura ambiente, y deseche el sobrenadante.
- Vuelva a suspender las células en 3 mL de medio de crecimiento básico fresco. De nuevo, centrifugar la suspensión celular durante 5 min a 200 × g y temperatura ambiente, y desechar el sobrenadante. Resuspender las células en 3 mL de medio de diferenciación fresco.
- Aspire las células 10 veces con una jeringa y una aguja para romper los grupos de células. Cuente las células con un hemocitómetro y siembre 106 células en un plato regular de 35 mm sin recubrimiento.
- Agregue al plato el volumen calculado de suspensión de MNP y el volumen del medio de diferenciación para lograr la concentración de MNP y el volumen total deseados. Mezcle las células, los MNP y el medio de diferenciación; incubar la placa en una incubadora humidificada con 5% de CO2 a 37 °C durante 24 h.
- Centrifugar la suspensión celular durante 5 min a 200 × g a temperatura ambiente y desechar el sobrenadante. Vuelva a suspender las células en 1 ml de medio de diferenciación fresco y cuente las células con un hemocitómetro.
>2. Diferenciación y crecimiento celular en plataforma magnética
- Limpie el sustrato estampado con etanol al 70% v/v/ y coloque el sustrato en una placa de cultivo de 35 mm en la campana. Coloque un imán grande (~1500 Oersted) debajo del sustrato estampado durante 1 minuto y retire el imán moviendo primero el plato hacia arriba y lejos del imán, y luego saque el imán de la cubierta. Enciende la luz ultravioleta durante 15 min.
- Cubra el sustrato con colágeno tipo 1 diluyendo colágeno tipo 1 (solución de cola de rata) 1:50 en etanol al 30% v/v. Para recubrir un plato de 35 mm, agregue 20 μL de colágeno a 1 mL de etanol al 30%.
- Cubra el plato con la solución y espere hasta que toda la solución se evapore, dejando el plato sin tapar durante unas horas. Lavar 3 veces en estéril 1x PBS; El portaobjetos de vidrio está listo para la siembra de células.
- Suspender las células después de la absorción celular de MNP, sembrar 105 células en una placa de cultivo de 35 mm y agregar 2 mL de medio de diferenciación. Incubar el cultivo en una incubadora humidificada al 5% de CO2 a 37 °C.
- Pasadas 24 h, añadir β-NGF murino fresco 1:100 (concentración final de 50 ng/mL). Renueve el medio de diferenciación y añada β-NGF murino fresco cada 2 días.
