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>1. Preparación de placas recubiertas de matriz de membrana basal calificadas para células madre embrionarias humanas (hESC)
- Descongele lentamente la solución de la matriz de membrana basal calificada para hESC (consulte la tabla de materiales) a 4 °C durante al menos 2-3 h o durante la noche para evitar la formación de un gel.
- Para preparar placas recubiertas de matriz de membrana basal, diluya la matriz en el medio Eagle modificado frío de Dulbecco con F12 (DMEM+F12) hasta una concentración final del 2%. Mezcle bien y cubra cada pocillo de una placa de 6 pocillos con 1 mL de la solución de matriz diluida.
- Incubar las placas recubiertas de matriz de membrana basal a temperatura ambiente (RT) durante al menos 3 h o a 4 °C durante la noche.
nota: Las placas con matriz de membrana basal pueden almacenarse a 4 °C durante 1 semana antes de retirar la solución de matriz y utilizar las placas.
>2. Adaptación de hESCs de tipo colonia al cultivo de hESCs de una sola célula
- Para pasar los cultivos libres de alimentador de las hESCs del tipo de colonia H9 (WA09) cultivadas en la matriz de la membrana basal, aspire el medio de los pocillos (Figura 1A).
- Lavar 1 vez con 1 ml de DPBS. Añadir 1 mL de solución de dispasa (1 U/mL) por pocillo e incubar a 37 °C durante 20 min.
- Retire la dispasa, lave las células 1 vez suavemente con 2 mL de DMEM/F12, retire el medio y agregue 2 mL de DMEM/F12 a cada placa.
- Separe suavemente las colonias pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo y transfiéralas a un tubo de 15 ml.
- Centrifugar los pellets durante 2 min a 370 x g y aspirar el medio.
- Para disociar los gránulos de células en células individuales, añadir 2 mL de solución de desprendimiento de células (concentración 1x, ver Tabla de Materiales) e incubar a 37 °C durante 10 min.
- Centrifugar las células durante 2 min a 370 x g y retirar la solución de desprendimiento.
- Añada un nuevo medio ESC humano mTeSR1 y disocie las células en células individuales mediante un pipeteo suave hacia arriba y hacia abajo.
- Para adaptar las hESCs de tipo colonia a un cultivo de tipo de una sola célula, coloque aproximadamente 1,5–2,0 x 106 hESCs en cada pocillo de la placa de 6 pocillos recubierta de matriz de membrana basal en 2 mL de mTeSR1 que contenga 10 μM de inhibidor de ROCK durante 24 h (Figura 1A).
- Después de 24 h, reemplace el medio hESC con mTeSR1 fresco sin inhibidor de ROCK y deje que las hESC crezcan como un tipo de una sola célula durante 3 días. Cambie el medio a diario.
- En el día 4, cuando los cultivos alcanzan casi el 100% de confluencia, disocie las células en una solución de desprendimiento, luego vuelva a plachar como se describe en el paso 2.6.
nota: El inhibidor de ROCK mejora la supervivencia celular durante las primeras 24 h de cultivo de hESC de tipo unicelular.
>3. Diferenciación de hESCs de tipo unicelular en NPCs (Figura 2)
- Para inducir la diferenciación de NPC, disocie las hESC de tipo unicelular con 1 mL de solución de desprendimiento (1x) e incube durante 10 min a 37 °C.
- Centrifugar las células durante 2 min a 370 x g y retirar el sobrenadante de la solución de desprendimiento. Añadir 1 ml de DMEM/F12 y resuspender las células mediante un pipeteo suave.
- Células de placa en una placa de 6 pocillos recubierta de matriz de membrana basal a una densidad de 2 x 105 células/pocillo en 2 mL de mTeSR1 que contiene 10 μM de inhibidor de ROCK.
- Después de 24 h, reemplace el medio de cultivo por un medio de inducción neural (DMEM con 1% de B27 menos vitamina A) suplementado con 1 μM de dorsomorfina y 5 μM SB431542.
- Cambie el medio cada dos días durante los primeros 4 días de inducción neuronal, luego todos los días hasta alcanzar la confluencia en el día 7 (Figura 2B).
NOTA: (1) La dorsomorfina inhibe la vía BMP al dirigirse a los receptores ALK2,3,6 y también inhibe la AMPK; SB431542 es un inhibidor de la vía TGFβ/Activina al dirigirse a ALK5,7. (2) El mismo protocolo se probó con otra línea ESC (WA01), que arrojó resultados similares a los WA09. (3) Generalmente hemos utilizado Matrigel para la matriz de la membrana basal; sin embargo, las células pueden cultivarse en Geltrex y luego diferenciarse en NPC con resultados muy similares, como lo indica la expresión de varios marcadores de NPC (Figura 3D, E). Manipule Geltrex de la misma manera que Matrigel (consulte la sección 1).
