Todos los procedimientos relacionados con la recolección de muestras se han realizado de acuerdo con las directrices del IRB del instituto.
1. Esterilización de materiales
NOTA: Todo el material y las soluciones deben esterilizarse antes de su uso.
- Esterilice todo el material quirúrgico y el material de corte de vibratomo (portacuchillas, disco de muestras, bandeja de almacenamiento intermedio) en un horno de esterilización seco durante 4 h a 180 °C.
- Esterilice material o equipo sensible a la temperatura mediante irradiación UV o gamma.
- Esterilice medios y soluciones por autoclave o filtración a través de membranas de poros de 0,22 μm.
>2. Preparación de soluciones
- Prepare 15-20 mL de solución de transporte: 50% v/v de solución salina balanceada de Hanks (HBSS) pH 7.4, 50% v/v medio basal para el mantenimiento de neuronas cerebrales postnatales y adultas (Tabla de Materiales), suplementado con 10 mM de ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanosulfónico (HEPES), 3 mg/mL de glucosa y 33 μg/mL de gentamicina.
nota: La solución de transporte debe estar refrigerada y oxigenada (burbujeando con gas carbógeno) durante al menos 20 minutos antes de la recolección de la muestra.
- Prepare 300 mL de solución de corte (HBSS suplementado con 10 mM de HEPES y 3 mg/mL de glucosa) y enfríelo en un congelador hasta el punto de formación inicial de cristales.
- Preparar 20 mL de medio de cultivo: medio basal para el mantenimiento de las neuronas cerebrales postnatales y adultas (Tabla de Materiales) suplementado con un derivado de L-glutamina al 1% (Tabla de Materiales), un suplemento al 2% para cultivo neural (Tabla de Materiales), penicilina/estreptomicina al 1% y 0,25 μg/mL de anfotericina B.
>3. Configuración del aparato de corte
>NOTA: Este protocolo se realiza idealmente con la ayuda de un colega debido a la logística de la recolección de muestras en el quirófano.
- En un cubo de hielo con sal añadida, deje reposar la solución de corte bajo la mezcla de carbógeno burbujeante (95% O2, 5% CO2) durante al menos 20 minutos antes de usar.
- Prepare un bloque de agarosa al 3% (aproximadamente 2 cm x 2 cm x 2 cm) y péguelo con pegamento al disco de muestra de vibratomo para crear un soporte mecánico adicional a la muestra de tejido durante el corte (Figura 1E).
- Ajuste el vibratomo para cortar: espesor de sección de 200 μm, frecuencia de vibración de 100 Hz y velocidad de corte entre 0,5-1,0 mm/s.
- Bloquee la bandeja tampón de vibratome en la base del vibratome y agregue hielo para mantenerla refrigerada antes de recibir la solución de corte y la muestra, y durante todo el procedimiento de corte.
4. Recogida de muestras
NOTA: En este protocolo, se recolectó tejido neocortical humano en la sala quirúrgica y se transportó al laboratorio.
>ATENCIÓN: Cuando se trate de muestras humanas, siga los protocolos de seguridad adecuados establecidos por la Institución.
- Configure el aparato de transporte (Figura 1C) que consta de: un cilindro de gas portátil con mezcla de carbógeno conectado a una válvula de presión/flujo que controla la salida de gas conectada a un tubo de silicona que conecta la salida de gas al recipiente de transporte; un recipiente de transporte, generalmente un tubo de centrífuga cónico de 50 mL con tapa perforada para la entrada de gas, que contiene la solución de transporte; y hielo para el enfriamiento de la muestra durante el transporte.
- Recoja y transporte el espécimen (Figura 1B) inmediatamente al laboratorio. Sumerja la muestra en una solución de transporte fría (constantemente burbujeada con la mezcla de carbógeno).
>5. Cortar
- Transfiera la muestra a una placa de Petri (100 mm x 20 mm) que contenga solución de corte y, con herramientas quirúrgicas finas, retire cuidadosamente la mayor cantidad posible de las meninges restantes en la muestra (Figura 1D).
- Elija la mejor orientación de la muestra para producir cortes con las características particulares del diseño experimental, y con una hoja de bisturí n.º 24, recorte una superficie plana para que la base se pegue al disco de la muestra.
- Con una cuchara de plástico desechable y pinceles delicados, recoja el fragmento de la placa de Petri y seque el exceso de solución con papel de filtro (seque por capilaridad y evite tocar el fragmento de tejido con papel).
- Con superpegamento, fije el tejido al disco de muestra de vibratomo hasta que esté firmemente adherido al disco y en contacto con el bloque de agarosa (Figura 1E).
- Coloque el disco de muestra de vibratomo (con el tejido correctamente adherido) en la bandeja tampón de vibratome llena de solución de corte que debe burbujear durante todo el proceso.
- Bloquee el soporte del cuchillo en su lugar con la hoja de afeitar firmemente fijada.
- La solución de corte debe cubrir tanto la muestra como la hoja, solo entonces debe comenzar a cortar (Figura 1F).
- Cortar la muestra en rodajas de 200 μm.
nota: Aunque algunos vibrátomos cortan las muestras automáticamente, la observación cercana y los pequeños ajustes en la velocidad de corte durante el proceso pueden ayudar a producir mejores rebanadas. Deseche las rebanadas irregulares iniciales.
- Transfiera las rodajas de la bandeja tampón a una placa de Petri con solución para cortar y recorte los bordes sueltos y el exceso de materia blanca en una proporción de alrededor del 70% de corteza/30% de materia blanca.
6. Cultura
NOTA: Realice este paso en una cabina de flujo laminar bajo un ambiente estéril.
- Añada 600 μL de medio de cultivo por pocillo (en una placa de 24 pocillos) e incube durante al menos 20 minutos a 36 °C y 5% deCO2 antes de sembrar las rodajas.
- Coloque una rebanada por pocillo con un pincel (Figura 1G).
- Si hay pozos sin usar en la placa, llénelos con 400 μL de agua estéril.
- Incubar la placa a 36 °C, 5% CO2.
nota: El primer reemplazo del medio debe realizarse entre 8-16 h después del enchapado, dependiendo del tamaño de la loncha.
- Suplementar 10 mL del medio de cultivo previamente preparado con 50 ng/mL de factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF).
nota: Durante las primeras 8-16 h, las lonchas se incuban en 600 μL de medio para evitar la privación de nutrientes y la acidificación, ya que se acelera el consumo de medio en esta fase. A partir del siguiente paso, el volumen de medio por pocillo se ajusta a 400 μL.
- Retire 333 μL del medio acondicionado de cada pocillo y agregue 133 μL de medio fresco suplementado con BDNF.
- Repita el proceso de reemplazo del medio cada 24 h reemplazando un tercio del medio acondicionado con medio fresco suplementado con BDNF.
