Aislamiento y cultivo de microglía a partir de cerebros de rata utilizando medios sin suero

Resumen

Fuente: Collins, H. Y., et al., Aislamiento y cultivo de microglía de roedores para promover una morfología ramificada dinámica en un medio libre de suero. J. Vis. Exp. (2018)

Este video muestra un método para aislar y cultivar microglía de cerebros de ratas. Consiste en separar la microglía de otras células neuronales y no neuronales mediante placas recubiertas con un anticuerpo monoclonal específico para la microglía.

Protocolo

Todos los procedimientos relacionados con la recolección de muestras se han realizado de acuerdo con las directrices del IRB del instituto.

1. Prepare una placa de Petri para la inmunopanificación de CD11b (Día 0)

NOTA: Prepare 1 plato de inmunopaneo por cada 1 - 2 cerebros de ratas juveniles.

1. Agregue 25 mL de solución de Tris pH 9.5 de 50 mM a una placa de Petri de 15 cm.
2. Añadir IgG anti-ratón de cabra (cadenas H+L) al plato hasta obtener una concentración final de 6 μg/mL. Gire la placa para distribuirla uniformemente.
3. Incubar la placa durante 1 - 3 h a 37 °C.
4. Enjuague los platos tres veces con DPBS++ (solución salina tamponada con fosfato (PBS) con Ca²⁺ y Mg²⁺), luego reemplácelos con una solución de tampón de paneo que contenga 1 μg/mL de anticuerpo OX42. Deje los platos toda la noche a temperatura ambiente sobre una superficie plana.

>2. Recolección de tejidos (Día 1)

NOTA: Este protocolo debería tardar ~3 - 4 h.

1. Antes de comenzar, asegúrese de que todas las soluciones estén estériles y enfriadas en hielo. Enfríe todos los instrumentos en hielo y esterilícelos con etanol antes de usarlos.
2. Siguiendo los procedimientos reglamentarios apropiados, sacrificar una rata de laboratorio juvenil por asfixia con dióxido de carbono.
   nota: Alternativamente, los animales más jóvenes pueden ser sacrificados con una dosis letal de ketamina/xilacina (100 - 200 μL de 24 mg/mL de ketamina, 2,4 mg/mL de xilacina). Se debe usar ketamina/xilacina si los animales tienen menos de 14 días de edad. Si utiliza varios animales, extraiga el tejido de un animal y colóquelo en DPBS⁺⁺ preenfriado sobre hielo antes de pasar a los animales siguientes.
3. Pellizque una pata trasera y asegúrese de que el animal no responda por completo antes de continuar.
4. Perfundir transcardialmente al animal con 10 - 30 mL de tampón de perfusión helado utilizando una aguja de 271/2-G hasta que el tampón salga limpio.
   nota: El volumen del tampón de perfusión variará en función del tamaño/edad del animal.
5. Inmediatamente después de la perfusión, retire la cabeza del animal. Viniendo de la médula espinal, corte el cóndilo occipital a cada lado con tijeras de disección, tenga cuidado de no dañar el cerebro. Después de cortar cada lado con cuidado, corte un lado a lo largo del hueso parietal y frontal hacia el hueso nasal. Con fórceps, tire cuidadosamente de la parte superior del cráneo, extraiga rápidamente el cerebro (o las estructuras del SNC de interés) y colóquelo en DPBS⁺⁺ preenfriado sobre hielo.
6. Repita para todos los animales restantes.
   nota: Todos los pasos posteriores deben realizarse en una campana de flujo laminar en condiciones estériles adecuadas.

>3. Disociación mecánica (Día 1)

1. Una vez que se hayan recolectado todos los cerebros, corte un cerebro en trozos de 1 mm³ en una placa de Petri sobre hielo con una hoja de bisturí fría y transfiéralo a un homogeneizador de onzas heladas con 5 a 7 ml de tampón de douncing helado. Disocia un cerebro a la vez.
2. Disocie el tejido con 10 a 20 movimientos suaves e incompletos con un homogeneizador de onzas holgado. Tenga cuidado de no aplastar directamente el tejido en la parte inferior del homogeneizador, sino que impulse el tejido a través del espacio entre los lados del pistón y el homogeneizador.
3. Retire con cuidado el pistón para evitar la introducción de burbujas de aire. Permita que los trozos de tejido mal disociados se depositen en el fondo del homogeneizador y transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo cónico refrigerado de 50 ml.
4. Reemplace el volumen eliminado con un tampón de douncing nuevo y repita los pasos 3.2 y 3.3 durante un total de 3 a 4 rondas, o hasta que todo el tejido se haya disociado. Repita el procedimiento para cada cerebro.

>4. Eliminación de mielina (Día 1)

NOTA: La eliminación de mielina se utiliza para el aislamiento de la microglía de animales mayores de P12.

1. Mida el volumen de la suspensión celular en el tubo cónico de 50 ml con una pipeta de 25 ml, luego agregue un tampón de douncing helado para ajustar el volumen total a 33,5 mL.
2. Agregue 10 mL de tampón de separación de mielina (MSB) a la suspensión celular y mezcle bien invirtiendo el tubo varias veces. Esto dará como resultado una concentración final del 23% de MSB en un volumen de 43,5 mL.
3. Celdas de centrífuga durante 15 min a 500 x g a 4 °C con frenado lento.
   nota: La centrífuga debería tardar aproximadamente 1,5 a 2 minutos en desacelerarse. Esto generará una capa superior de mielina y restos de células muertas, un sobrenadante algo turbio, y una bolita más pequeña que está enriquecida para células vivas.
4. Retire la capa superior de mielina/residuos y el sobrenadante con una pipeta. Tenga cuidado al quitar la capa superior para asegurarse de que se elimine la mayor cantidad posible.
5. Vuelva a suspender el pellet de celda en 12 mL de tampón de paneo. Tritura suavemente la suspensión celular para romper cualquier grupo de células que pueda quedar.

>5. Inmunopanning (Día 1)

1. Pase la suspensión celular a través de un filtro celular de 70 μm para eliminar los desechos grandes o los grupos celulares.
2. Enjuague la bandeja panorámico recubierta de OX42 tres veces con DPBS++. No permitas que la placa se seque por completo entre lavados.
3. Vierta el último lavado DPBS++ y aplique la suspensión de celda filtrada a la placa de paneo. Gire suavemente la placa para distribuir las células, luego incube la placa en una superficie plana a temperatura ambiente durante 20 minutos para permitir que las células se adhieran. No incube más de 20 minutos o las células se volverán muy difíciles de recuperar del plato.
4. Enjuague la placa de paneo con DPBS++ 10 veces para eliminar las células no adherentes. La microglía se adherirá firmemente a la placa, así que agite la placa con cada enjuague para asegurar la eliminación de otras células no adherentes.
5. Vierta el último lavado de DPBS⁺⁺ y reemplácelo con 15 ml de DPBS++ y 200 μL de tripsina (solución madre al 1,25%).
6. Incubar la placa durante ≤10 min a 37 °C con 10% de CO₂ para tripsinizar.
   nota: No continúe más de 10 minutos o la microglía será difícil de eliminar.
7. Después de 10 minutos de tripsinización, la microglía todavía estará adherida a la placa. Vierta tripsina/DPBS⁺⁺ y lave suavemente 2 veces con DPBS⁺⁺ para eliminar la tripsina, reemplácelo con 12 ml de medio de crecimiento de microglía (MGM) helado.
8. Coloque el plato de paneo sobre hielo durante 2 minutos para ayudar a debilitar la interacción entre la célula y el sustrato, y asegúrese de que el plato esté plano para evitar que se sequen áreas del plato.
9. Pipetee vigorosamente con una pipeta de 10 ml y un controlador de pipeta a alta velocidad para recuperar las células de la placa de paneo. Dibuja una cuadrícula de 16 x 16 con el chorro de líquido de la pipeta para intentar eliminar todas las células.
10. Revise las células bajo un microscopio con un aumento de 20X para asegurarse de que las células se hayan desprendido de la placa. Marque los puntos en la parte superior de la placa donde las células aún están atascadas y repita el pipeteo en esas áreas.
11. Recoja la suspensión celular y alícuota de 3 a 4 mL de sobrenadante por tubo cónico de 15 mL. Centrifugar durante 15 min a 500 x g a 4 °C con frenado lento.
    nota: El giro de la microglía a través de un pequeño volumen permite la máxima recuperación de las células.
12. Aspirar el sobrenadante, dejando 0,5 mL de MGM con el pellet de células.
13. Vuelva a suspender cada gránulo en el MGM restante y agrupe las células de todos los tubos.
14. Cuente las células con hemocitómetro.
15. Celdas de placa como se describe en los pasos 6 y 7 según la aplicación.
16. Cultivo de células a 37 °C con 10% de CO₂.
    nota: Las células se pueden cultivar hasta 3 a 4 semanas con cambios regulares de medios o una semana sin cambios de medios.

>6. Recubrimiento puntual de placas de cultivo de tejidos/cubreobjetos (Día 1)

1. Coloque 15 μL de recubrimiento de colágeno IV directamente en el centro de una placa de cultivo de tejidos con recubrimiento aniónico/catiónico de 24 pocillos (consulte la Tabla de materiales para obtener más detalles) e incube durante 15 minutos a 37 °C con 10% de CO₂.
2. Después de contar las células con hemocitómetro, diluya las células a 2,3 x 10⁵/mL en MGM. Aspire el punto IV de colágeno e inmediatamente coloque 15 μL de suspensión celular en este punto; Esto dará 3.5 x 10³ celdas/punto. Incubar durante 5 a 10 min a 37 °C con 10% de CO₂ para permitir que las células se adhieran, añadir 500 μL de TGF-β2/IL-34/medio de crecimiento (TIC) que contenga_CO2 equilibrado con CO 2 suavemente al pocillo.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Búfer de douncing			Receta: 200 μL de DNaseI al 0,4% en 50 mL de DPBS++ Observaciones: Úselo cuando esté helado
Búfer de panorámica			Receta: 2 mg/mL de peptona de sólidos lácteos en DPBS++
Medio de crecimiento de microglía (MGM)			Receta: DMEM/F12 que contiene 100 unidades/mL de penicilina, 100 μg/mL de estreptomicina, 2 mM de glutamina, 5 μg/mL de N-acetilcisteína, 5 μg/mL de insulina, 100 μg/mL de apotransferrina y 100 ng/mL de selenito de sodio Observaciones: Use MGM helado para desplazar la microglía fuera del plato de inmunización.
Recubrimiento de colágeno IV			Receta: MGM que contiene 2 μg/mL de colágeno IV
Tampón de separación de mielina			Receta: 9 mL de Percoll PLUS, 1 mL 10x PBS sin Ca++ y Mg++, 9 μL 1 M de CaCl2, 5 μL 1 M de MgCl2 Observaciones: Mezclar bien después de la adición de CaCl2 y MgCl2
tripsina	sigma	T9935
DMEM/F12	Gibco	21041-02
Penicilina/ Estreptomicina	Gibco	Números 15140-122
DMEM (glucosa alta)	Gibco	11960-044
Colágeno IV			Reconstitución: 200 μg/mL en PBS Concentración utilizada: 1:100 Almacenamiento: -80°C
ratón anti-rata CD11b monoclonal (clon OX42)	Bio-Rad	MCA275R	Panorámica: 1:1.000; Tinción: 1:500
TGF-b2/IL-34/Medios de crecimiento que contienen colesterol (TIC)			Receta: MGM que contiene 2 ng/mL de TGF-b2 humano, 100 ng/mL de IL-34 murino, 1,5 μg/mL de colesterol de lana ovina, 10 μg/mL de heparán sulfato, 0,1 μg/ml de ácido oleico y 0,001 μg/ml de ácido gondoico Observaciones: Asegúrese de añadir colesterol a los medios calentados a 37 °C y no añada más de 1,5 μg/mL o se precipitará. No filtre los medios que contengan colesterol. Equilibre los medios TIC con 10% de CO2 durante 30 minutos a 1 hora antes de agregarlos a las celdas para asegurar un pH óptimo.
Percoll PLUS	GE Cuidado de la Salud	Cat# 17-5445-02
Placas Primarias	VWR	Cat# 62406-456
DNaseI	Worthington	Cat# DPRFS