Preparación de secciones cerebrales utilizando un método de recuperación protectora basado en NMDG

Resumen

Fuente: Ting, J. T. et al. Preparación de cortes agudos de cerebro utilizando un método optimizado de recuperación protectora de N-metil-D-glucamina. J. Vis. Exp. (2018).

Este video describe un protocolo para obtener cortes de cerebro utilizando un método de recuperación protectora basado en N-Metil-D-glucamina (NMDG). Un cerebro diseccionado se incuba en un aCSF con NMDG y HEPES para minimizar la muerte y el daño de las células neuronales durante el seccionamiento. Se permite que la sección se recupere en el aCSF para restaurar las actividades celulares

Protocolo

1. Disección y corte de cerebro

1. Decapita al animal. Use un bisturí para abrir la piel de la cabeza y exponer la tapa del cráneo.
2. Use unas tijeras finas súper cortadas para cortar la piel sobre la tapa del cráneo y haga pequeñas incisiones laterales a cada lado en la base caudal/ventral del cráneo. Realice cortes superficiales adicionales comenzando en la cara caudal/dorsal del cráneo, moviéndose en la dirección rostral hacia arriba por la línea media dorsal teniendo cuidado de no dañar el cerebro subyacente. Haga un corte final en 'T' perpendicular a la línea media a la altura de los bulbos olfativos.
   nota: Se debe tener cuidado para asegurarse de que no se dañe la(s) región(es) cerebral(es) de interés. En particular, en ningún momento se debe aplicar ninguna fuerza de compresión sobre el cerebro mismo.
3. Utilice las pinzas de punta redonda para agarrar el cráneo, comenzando en la cara rostral-medial y despegue hacia atrás hacia la dirección caudal-lateral. Repita para que ambos lados se abran y retire las mitades dorsales de la tapa del cráneo para exponer el cerebro. Saque suavemente el cerebro intacto y colóquelo en el vaso de precipitados de NMDG-HEPES aCSF preenfriado. Deje que el cerebro se enfríe uniformemente durante ~ 1 min.
4. Use la espátula grande para levantar el cerebro del vaso de precipitados y colocarlo en la placa de Petri cubierta con papel de filtro. Recorte y bloquee el cerebro de acuerdo con el ángulo preferido de corte y la región cerebral deseada de interés. Trabaje rápidamente para evitar la privación prolongada de oxígeno durante la manipulación.
   nota: Son posibles muchos ángulos de corte. El método exacto de bloqueo y el ángulo de corte dependerán de la región exacta del cerebro, el tipo de célula y el circuito que se estudiará.
5. Fije el bloque cerebral al portamuestras con pegamento adhesivo. Retraiga la pieza interior del portamuestras lo suficiente como para retirar el bloque cerebral por completo. Vierta la agarosa fundida directamente en el soporte hasta que el bloque cerebral esté completamente cubierto de agarosa. Sujete el bloque de enfriamiento de accesorios preenfriado alrededor del portamuestras durante ~ 10 s hasta que la agarosa se haya solidificado.
6. Inserte el portamuestras en el receptáculo de la máquina cortadora y verifique la alineación adecuada. Llene el depósito con el resto de NMDG-HEPES aCSF oxigenado y preenfriado del vaso de precipitados de 250 ml y mueva una piedra de burbujas al depósito durante el corte para garantizar una oxigenación adecuada.
7. Ajuste el micrómetro para comenzar a avanzar el espécimen de cerebro incrustado en agarosa. Inicie la cortadora y ajuste empíricamente la velocidad de avance y la frecuencia de oscilación al nivel deseado.
   nota: Ambas configuraciones deben estar en el rango bajo. Para obtener los mejores resultados, una sola pasada del brazo de la cuchilla debe durar aproximadamente 20 segundos y la oscilación debe producir un zumbido muy suave y suave sin zumbidos manifiestos.
8. Continúe avanzando y cortando el tejido en incrementos de 300 μm (u otro grosor preferido) hasta que la región del cerebro de interés esté completamente seccionada; el tiempo total para el procedimiento de corte debe ser inferior a 15 minutos.

>2. Procedimiento de recuperación de protección NMDG optimizado

1. Paso inicial de recuperación de NMDG (paso crítico): Una vez finalizado el procedimiento de seccionamiento, recoja todas las lonchas con una pipeta Pasteur de plástico recortada y transfiéralas a una cámara de recuperación inicial precalentada (34 °C) llena de 150 ml de NMDG-HEPES aCSF. Transfiera todas las lonchas en una sucesión corta e inicie un temporizador tan pronto como todas las rebanadas se muevan a la cámara de recuperación.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Compresstoma VF-200	Instrumentos de precisión	VF-200	Cortadora de pañuelos vibratoria (recomendado)
N-metil-D-glucamina	Sigma Aldrich	M2004	aConstituyente del CSF
cloruro de sodio	Sigma Aldrich	S3014	aConstituyente del CSF
Cloruro de potasio	Sigma Aldrich	P5405	aConstituyente del CSF
Fosfato de sodio monobásico dihidratado	Sigma Aldrich	71505	aConstituyente del CSF
Bicarbonato de sodio	Sigma Aldrich	S5761	aConstituyente del CSF
HEPES	Sigma Aldrich	H4034	aConstituyente del CSF
glucosa	Sigma Aldrich	G7021	aConstituyente del CSF
Ascorbato de sodio	Sigma Aldrich	A4034	aConstituyente del CSF
tiourea	Sigma Aldrich	T8656	aConstituyente del CSF
Piruvato de sodio	Sigma Aldrich	P5280	aConstituyente del CSF
Cloruro de calcio dihidratado	Sigma Aldrich	C7902	aConstituyente del CSF
Sulfato de magnesio heptahidratado	Sigma Aldrich	M1880	aConstituyente del CSF
Pinzas romas curvadas	Herramientas de Bellas Ciencias	11065-07	Herramientas de disección cerebral
Tijeras finas de disección (supercut)	Herramientas de Bellas Ciencias	14058-09	Herramientas de disección cerebral
Tijeras grandes y resistentes de 7''	Herramientas de Bellas Ciencias	14000-18	Herramientas de disección cerebral
Espátula de metal	Sigma Aldrich	Z511455-1PAK	Herramientas de disección cerebral
Afeitar	VWR	89031-954	Herramientas de disección cerebral
Rebanada de cerebro Keeper-4	Automatiza la ciencia	S-BSK4	cámara de retención de rebanadas de cerebro
malla de nailon	Instrumentos Warner	64-0198	Para la construcción de cámaras de recuperación de lonchas pequeñas
Vaso de precipitados de vidrio Pyrex (250 mL)	VWR	89090-434	Para la construcción de cámaras de recuperación de lonchas pequeñas
Plato de plástico de 35 mm, redondo	VWR	100488-376	Para la construcción de cámaras de recuperación de lonchas pequeñas
Piedras difusoras de gas (10 μm)	Sigma Aldrich	59277	Para una carbogenación constante (burbujas finas)
Agarosa Tipo I-B	Sigma Aldrich	A0576	Para incrustar muestras de cerebro
ácido clorhídrico	Sigma Aldrich	H1758-100ML	Para el ajuste del pH de los medios
hidróxido sódico	Sigma Aldrich	221465-25G	Para el ajuste del pH de los medios
Hidróxido de potasio	Sigma Aldrich	221473	Para el ajuste del pH de los medios
Pipetas de transferencia de plástico 3 mL graduadas	VWR	89497-676	Para la transferencia de rebanadas
Cuchillas inyectoras de cerámica de circonio	Cuchillas especiales de cadencia	EF-INZ10	http://cadenceinc.com/
Baño de agua caliente (2.5L)	VWR	13491-060	misceláneo
Redondos de papel de filtro	VWR	28456-022	misceláneo
Pegamento de cianoacrilato	amazona	B000BQRBO6	misceláneo
Placa de Petri de vidrio	VWR	89000-326	misceláneo
10X Solución salina tamponada con fosfato	Sigma Aldrich	P5493	misceláneo
Termomezclador (con bloque de tubo de 1,5 ml)	VWR	89232-908	Para mantener la agarosa fundida