1. Disección y corte de cerebro
- Decapita al animal. Use un bisturí para abrir la piel de la cabeza y exponer la tapa del cráneo.
- Use unas tijeras finas súper cortadas para cortar la piel sobre la tapa del cráneo y haga pequeñas incisiones laterales a cada lado en la base caudal/ventral del cráneo. Realice cortes superficiales adicionales comenzando en la cara caudal/dorsal del cráneo, moviéndose en la dirección rostral hacia arriba por la línea media dorsal teniendo cuidado de no dañar el cerebro subyacente. Haga un corte final en 'T' perpendicular a la línea media a la altura de los bulbos olfativos.
nota: Se debe tener cuidado para asegurarse de que no se dañe la(s) región(es) cerebral(es) de interés. En particular, en ningún momento se debe aplicar ninguna fuerza de compresión sobre el cerebro mismo.
- Utilice las pinzas de punta redonda para agarrar el cráneo, comenzando en la cara rostral-medial y despegue hacia atrás hacia la dirección caudal-lateral. Repita para que ambos lados se abran y retire las mitades dorsales de la tapa del cráneo para exponer el cerebro. Saque suavemente el cerebro intacto y colóquelo en el vaso de precipitados de NMDG-HEPES aCSF preenfriado. Deje que el cerebro se enfríe uniformemente durante ~ 1 min.
- Use la espátula grande para levantar el cerebro del vaso de precipitados y colocarlo en la placa de Petri cubierta con papel de filtro. Recorte y bloquee el cerebro de acuerdo con el ángulo preferido de corte y la región cerebral deseada de interés. Trabaje rápidamente para evitar la privación prolongada de oxígeno durante la manipulación.
nota: Son posibles muchos ángulos de corte. El método exacto de bloqueo y el ángulo de corte dependerán de la región exacta del cerebro, el tipo de célula y el circuito que se estudiará.
- Fije el bloque cerebral al portamuestras con pegamento adhesivo. Retraiga la pieza interior del portamuestras lo suficiente como para retirar el bloque cerebral por completo. Vierta la agarosa fundida directamente en el soporte hasta que el bloque cerebral esté completamente cubierto de agarosa. Sujete el bloque de enfriamiento de accesorios preenfriado alrededor del portamuestras durante ~ 10 s hasta que la agarosa se haya solidificado.
- Inserte el portamuestras en el receptáculo de la máquina cortadora y verifique la alineación adecuada. Llene el depósito con el resto de NMDG-HEPES aCSF oxigenado y preenfriado del vaso de precipitados de 250 ml y mueva una piedra de burbujas al depósito durante el corte para garantizar una oxigenación adecuada.
- Ajuste el micrómetro para comenzar a avanzar el espécimen de cerebro incrustado en agarosa. Inicie la cortadora y ajuste empíricamente la velocidad de avance y la frecuencia de oscilación al nivel deseado.
nota: Ambas configuraciones deben estar en el rango bajo. Para obtener los mejores resultados, una sola pasada del brazo de la cuchilla debe durar aproximadamente 20 segundos y la oscilación debe producir un zumbido muy suave y suave sin zumbidos manifiestos.
- Continúe avanzando y cortando el tejido en incrementos de 300 μm (u otro grosor preferido) hasta que la región del cerebro de interés esté completamente seccionada; el tiempo total para el procedimiento de corte debe ser inferior a 15 minutos.
>2. Procedimiento de recuperación de protección NMDG optimizado
- Paso inicial de recuperación de NMDG (paso crítico): Una vez finalizado el procedimiento de seccionamiento, recoja todas las lonchas con una pipeta Pasteur de plástico recortada y transfiéralas a una cámara de recuperación inicial precalentada (34 °C) llena de 150 ml de NMDG-HEPES aCSF. Transfiera todas las lonchas en una sucesión corta e inicie un temporizador tan pronto como todas las rebanadas se muevan a la cámara de recuperación.
