Una técnica para la incubación prolongada del tejido neuronal de la retina

Resumen

Fuente: Cameron, M. A., et al. Incubación prolongada de tejido neuronal agudo para electrofisiología e imágenes de calcio. J. Vis. Exp. (2017).

Este video muestra un método para la incubación prolongada del tejido neuronal de la retina. Los oculares que contienen retina se obtienen de un ojo de ratón; la membrana limitante interna (ILM) se digiere enzimáticamente para exponer las células neuronales de la retina, y el ocular tratado o la retina aislada se transfiere a una incubadora especializada para una incubación prolongada a baja temperatura.

Protocolo

Todos los procedimientos relacionados con la recolección de muestras se han realizado de acuerdo con las directrices del IRB del instituto.

1. Preparación del montaje completo de la retina y eliminación de la membrana limitante interna

1. Prepare los montajes completos de retina en condiciones normales de iluminación de laboratorio o con luz roja/infrarroja tenue.
2. Eutanasiar al animal por luxación cervical y enuclear inmediatamente los ojos. Haga un pequeño corte a lo largo de la ora serrata y colóquelo en medio Ames o en líquido cefalorraquídeo artificial (aCSF) que contenga (mM): 125 NaCl, 25 NaHCO₃, 3 KCl, 2 CaCl₂, 1 MgCl₂, 10 glucosa, 0,5 L-glutamina y sature con carbógeno (mezcla de 95% O₂/5% CO₂; ~300 mOsm; pH 7.4), a temperatura ambiente (RT).
3. Retire inmediatamente la córnea, el cristalino y el vítreo cortando a lo largo de la ora serrata con unas tijeras pequeñas y retirando el cristalino y el vítreo con pinzas. Coloque el tejido en el sistema de incubación a RT.
   nota: El tejido de la retina puede mantenerse en el ocular, después de una lenta reducción de la temperatura a 15 - 16 °C, durante >24 h en el sistema de incubación hasta que sea necesario.
4. Para extraer el ILM, transfiera el ocular que contiene la retina a un pequeño frasco de vidrio que contenga 30 U/mL de papaína, 1 mM de L-cistina, 0,5 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) y 0,005% de desoxirribonucleasa (DNasa) en una solución salina equilibrada de Earl's (BSS) a 37 °C durante 20 min. Aplique 95% O₂/5% CO₂ a la solución a través de la tapa, pero no burbujee. Si usa tejido de animales jóvenes (<6 semanas), diluya la solución a la mitad de su concentración.
   1. Detenga la digestión enzimática colocando el tejido en una solución de ovomucoide (10 mg/mL) y albúmina sérica bovina (BSA, 10 mg/mL) durante 10 min en el BSS de Earl. Lave bien el tejido con aCSF antes de transferirlo al sistema de incubación y reduzca la temperatura a 15 - 16 °C.
5. Mantenga el tejido de la retina en el ocular hasta que lo necesite. Para transferirla al microscopio, aísle la retina del ocular y córtela en 4 pedazos con una cuchilla de afeitar. Si se requiere toda la retina, haga cuatro pequeños cortes en la periferia de la retina para permitir que quede plana><. nota: Para experimentos de imagen, cargue con colorantes de calcio antes de transferirlos al sistema de incubación, consulte a continuación.

>2. Mantenimiento del tejido en la incubadora

1. Coloque el tejido en la cámara principal que contiene las sondas para las mediciones de pH y temperatura (Figura 1A, B).
2. Hacer circular el aCSF a través de una segunda cámara (cámara UVC, construida como se describió anteriormente) aislada de la cámara principal y expuesta a una luz ultravioleta C (UVC) de 1,1 W (254 nm, lámpara UV esterilizadora de 5W/2P) para erradicar las bacterias que flotan en la solución (Figura 1A). Controle la temporización de la luz UVC a través de un temporizador programable mediante una función aleatoria que se enciende a veces que varía entre 15 y 26 minutos cada 15 a 30 minutos para evitar el calentamiento excesivo del aCSF.
3. Ajuste el caudal en la cámara UVC a 12 mL/min como se informó anteriormente. Cubra la cámara UVC con papel de aluminio para evitar la iluminación UVC fuera de la cámara, que puede dañar el tejido neuronal.
   nota: Para el tejido de la retina adaptado a la oscuridad, aplique una cubierta hecha a medida en la cámara principal para excluir la luz.
4. Utilice una bomba peristáltica para hacer circular la solución (aCSF) a través de las dos cámaras y un enfriador termoeléctrico de placa fría Peltier para enfriar o calentar la cámara principal a las temperaturas deseadas en el rango de 0 a 50 °C. Para una incubación óptima de los tejidos, utilice 15 - 16 °C para una viabilidad a largo plazo.

Resultados

Figura 1. Un sistema de incubación que permite una regulación estricta del entorno tisular. A, Diagrama esquemático del sistema de incubación compuesto por una placa Peltier de enfriamiento, una cámara principal, una bomba peristáltica y una cámara UVC. B, Vista lateral de la cámara principal que muestra los puntos de entrada y salida del aCSF, así como las sondas de entrada de carbó...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
cloruro de sodio	Sigma Aldrich VETEC	V800372
Cloruro de potasio	Sigma Aldrich	P9333
N-metil-D-glucamina	Sigma Aldrich	M2004
D-glucosa	Sigma Aldrich	G5767
Bicarbonato de sodio	Sigma Aldrich	S6014
Cloruro de magnesio	Sigma Aldrich	M9272
Cloruro de calcio	Sigma Aldrich	223506
Sistema de disociación de papaína	Worthington	LK003150
Microscopio vertical de platina fija	Olimpo	BX51WI
Objetivo del microscopio	Olimpo	XLUMPlanFLN 20x/1.00w	20 veces
Objetivo del microscopio	Olimpo	LUMPlanFLN 60x/1.00w	60X
Braincubadora	Payo Científico	BR26021976	www.braincubator.com.au
Enfriador de placa fría Peltier-termoeléctrico	Tecnología TE	CP-121
Controlador de temperatura	Tecnología TE	TC-36-25 RS232