1. Preparación de materiales y medio de cultivo
- Para la disección y disociación de la SCZ (zona subcallosa), envuelva la matriz cerebral, la hoja de afeitar de doble filo y las pinzas con papel de aluminio, y luego esterilícelas en autoclave.
- Prepare 50 ml de tampón PBS (solución salina tamponada con fosfato) frío para lavar todo el cerebro del ratón.
- Instale un microscopio de disección y prepare las herramientas quirúrgicas necesarias para la disección del cerebro (tijeras y pinzas esterilizadas en autoclave) y el aislamiento de la SCZ (jeringa de 1 ml, aguja de 30 G, matriz cerebral y pinzas finas).
- Preparación de N2 Medium:
- Prepare el medio F-12/DMEM (+L-glutamina, +bicarbonato de sodio) con 2% de B27, 1% de suplementos de N2 y 1% de penicilina-estreptomicina.
Nota: El medio de crecimiento consta de medio N2 y factores de crecimiento (20 ng/mL de factor de crecimiento epidérmico purificado (EGF) y 20 ng/mL de factor de crecimiento básico de fibroblastos (bFGF2)).
- Prepare un tampón de digestión (40 unidades/ml de papaína, 2,4 unidades/ml de dispasa II y 2% de penicilina-estreptomicina en PBS) para la digestión de tejidos.
- Preparación de la placa de recubrimiento y el cubreobjetos:
- Preparar poli-L-ornitina (PLO; 0,01%) y laminina (10 μg/ml disueltos en DH2O). Para recubrir placas de 6 pocillos para el mantenimiento de SCZ-aNSC (células madre neurales adultas) como una monocapa o cubreobjetos de 18 mm para inmunotinción, incubarlos con PLO durante la noche a 4 °C. A continuación, lávelos 3 veces con DH2O. Deje que las placas y los cubreobjetos se sequen después del último lavado.
- A continuación, incubar las placas con laminina durante la noche a 4 °C. A continuación, lávelos 3 veces con DH2O.
Precaución: No seque la laminina, ya que afectará la adhesión de la célula.
Nota: Las soluciones de recubrimiento se pueden reutilizar 3 veces.
2. Aislamiento y disociación de la SCZ adulta
- Antes de la preparación del cultivo, coloque la matriz cerebral y la navaja de afeitar de doble filo sobre hielo.
Nota: No congele la matriz cerebral, porque el cerebro podría adherirse a ella.
- Sacrificar un ratón (8 semanas de edad) por asfixia por CO2 o luxación cervical.
- Corte la cabeza con unas tijeras afiladas después de rociar etanol al 70%. Para inmovilizar la cabeza, sostenga ambos lados de la cabeza con fuerza. Corta la piel con unas tijeras en la línea media en dirección caudal-rostral. Esto promueve la eliminación completa de la piel del cráneo.
- Retire primero la parte caudal del cráneo (posterior a la lambda) y luego inserte las pinzas entre el cráneo y el cerebro en la posición de la línea media dorsal. Agarra el hueso parietal izquierdo (o derecho) y retíralo con cuidado. Repita este procedimiento para la extracción del otro hueso parietal.
Nota: La desconexión del nervio óptico y la extirpación de las meninges del cerebro facilitan la separación del cerebro del cráneo.
- Transfiera el cerebro a un tampón PBS frío (25 ml) y enjuáguelo dos veces para eliminar el exceso de sangre.
- Coloque el cerebro en la matriz cerebral sobre hielo y haga cortes coronales para obtener rodajas de 1 mm de grosor. Transfiera los cortes de cerebro (1 mm) que contienen las regiones SCZ que se encuentran en la parte posterior del cerebro a un PBS frío en una placa de Petri de plástico de 35 mm.
cautela: Para obtener un plano paralelo de secciones coronales, asegúrese de que la fisura cerebral esté colocada en la línea media de la matriz cerebral; Es fundamental evitar variaciones innecesarias en las secciones.
nota: Obtener cortes de cerebro a 2-3 mm posteriores al bregma; esto permite la separación de la SCZ de la SVZ (zona subventricular).
- Bajo el microscopio de disección con un aumento bajo, microdiseccione la SCZ del área de la sustancia blanca de la corteza y el hipocampo con una aguja 30G doblada6,9. A continuación, extirpe las regiones de la corteza por encima de la SCZ. Coloque la región SCZ disecada de las rodajas en una placa de Petri de plástico de 35 mm sobre hielo sin PBS frío.
nota: La contaminación de regiones adicionales que contienen neuronas maduras podría afectar la viabilidad de las aNSC y la formación de neurosferas, ya que sufren la muerte celular en condiciones de cultivo de aNSC.
- Con una aguja doblada de 30 G, corte inmediatamente los tejidos disecados en trozos pequeños.
nota: Si se requiere más tiempo para diseccionar el tejido SCZ, sumerja los tejidos disecados en PBS frío antes de picarlos.
- Vuelva a suspender el tejido picado con 1 ml de tampón de digestión, transfiera el tejido a un tubo de 15 ml que contenga 2 ml de tampón de digestión e incube durante 30 min en un baño de agua a 37 ° C.
nota: Agite el tubo cada 10 minutos para mezclar bien.
3. Cultivo de células madre neurales adultas derivadas de la zona subcallosa
- Golpee suavemente el tubo para disociar el tejido digerido y, a continuación, centrifugue el tubo a 145 x g durante 5 min. Deseche el sobrenadante, vuelva a suspender el tejido digerido con 1 mL de medio N2 precalentado para lavar el tampón de digestión y pipetee suavemente la solución de muestra un máximo de 5 veces con una pipeta P1000.
nota: La trituración excesiva con una punta de pipeta estrecha puede disminuir la viabilidad de la célula y el crecimiento posterior.
- Centrifugar el tubo a 145 x g durante 5 min. Después de desechar el sobrenadante, vuelva a suspender el pellet celular en 1 ml de medio N2.
- Prepare 1 ml de medio N2 en una placa de 6 pocillos sin recubrimiento y agregue 1 ml de las células suspendidas para hacer un volumen final de 2 ml.
- Añada EGF (20 ng/ml) y bFGF (20 ng/ml) en cada pocillo. Agite suavemente la placa de cultivo de 6 pocillos con la mano para mezclar los factores de crecimiento agregados con las células en placa. Mantenga la placa de 6 pocillos en una incubadora a 37 °C y 5 % deCO2.
- Agregue EGF (20 ng/ml) y bFGF (20 ng/ml) a cada pocillo todos los días durante 8 días. Cada tres días, agregue 200 μl de medio N2 para mantener el volumen aproximado de 2 ml del medio.
4. Pase de las NSCs como Neuroesferas y a Cultivos Monocapa
- Recoja las neuroesferas y transfiérelas a un nuevo tubo cónico de 15 ml.
Nota: El número de neuroesferas (>50 μm de diámetro) por pocillo de la SCZ de un solo cerebro de ratón fue de 64,3 ± 7,31, que fue menor que el de la SVZ (190,5 ± 6,33).
- Incubar las neuroesferas con 0,5 ml de tampón de disociación durante 5 minutos en un baño de agua a 37 °C para disociar las neuroesferas en células individuales. Las neuroesferas primarias pueden disociarse en células individuales y mantenerse a lo largo de varios pasajes como neuroesferas o cultivos monocapa.
nota: La expansión de las SCZ-aNSCs como monocapa es superior a las neurosferas porque las SCZ-aNSCs pueden ser >10 veces en un formato de cultivo monocapa, pero <5 veces en un formato de cultivo de neurosfera.
cautela: Las SCZ-aNSC exhiben una fuerte agregación y es difícil disociarlas en células individuales. Por lo tanto, el formato de cultivo de neurosfera no se recomienda para la expansión celular rutinaria.
- Pipetear suavemente la solución de muestra hacia arriba y hacia abajo con una pipeta P1000 menos de 5 veces y centrifugar el tubo a 145 x g durante 5 min. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las neuroesferas con 1 ml de medio N2.
nota: La sobrevaloración con una punta de pipeta estrecha puede disminuir la viabilidad celular y el crecimiento posterior.
- Para contar las células, haga una mezcla 1:1 de la suspensión celular (10 μl) y la solución de azul de tripán al 0,4%, y luego cuente el número de células vivas en un hematocitómetro. Después de recubrir una placa de 6 pocillos con PLO/laminina, coloque las celdas a 2,5 x 105 celdas/ml con 2 ml de medio N2 para cada pocillo.
nota: Los cambios en la densidad celular pueden afectar su condición y potencial de diferenciación.
- Mantener las SCZ-aNSCs con un tratamiento diario de factores de crecimiento (2 ml, 20 ng/ml) durante 5 días, y luego pasarlas.
5. Diferenciación de células madre neurales adultas derivadas de la zona subcallosa
- Coloque las aNSC en un cubreobjetos de 18 mm recubierto de PLO/laminina con 1 x 105 células/ml en 1 ml de N2 con factores de crecimiento (20 ng/ml) para la diferenciación de las SCZ-aNSC.
- Al día siguiente, cuando las células estén firmemente adheridas al cubreobjetos, intercambie el medio de crecimiento con N2 para eliminar los factores de crecimiento.
- Después de 6 días, lavar las células diferenciadas con 1 ml de PBS para eliminar los restos celulares y fijarlos para la inmunotinción.
Nota: BrdU puede incorporarse al ADN recién sintetizado de las células en proliferación. Por lo tanto, si se desea, se puede agregar BrdU (10 μg/ml) a las células vivas antes de la fijación de las células.
