>1. Cultivo y almacenamiento de células endoteliales periventriculares humanas
- Mantener las células endoteliales periventriculares humanas en placas de 6 pocillos recubiertas de matriz de membrana basal (ver Tabla de Materiales) en medio de células endoteliales periventriculares (medio E6 que contiene 50 ng/mL de factor de crecimiento endotelial vascular A [VEGF-A], 100 ng/mL de factor de crecimiento de fibroblastos 2 [FGF2] y 5 μM de ácido gamma-aminobutírico [GABA]) a 37 °C y 5% de CO2. Cambie de medio cada dos días.
- Descongele la matriz de la membrana basal a 4 °C y haga una solución 1:100 diluyéndola en medio frío de medio Eagle modificado/mezcla de nutrientes F-12 (DMEM/F12) de Dulbecco. Cubra cada pocillo de una placa de 6 pocillos con 1 mL de solución de matriz. Incubar las placas a 37 °C durante al menos 1 h antes de su uso.
- Permitir que las células endoteliales periventriculares humanas alcancen una confluencia del 80%-90%. Aspire el medio del pozo. Lave los pocillos una vez con 1 mL de solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS) 1x por pocillo.
- Separe las celdas agregando 1 mL de solución de disociación celular (consulte la Tabla de materiales) por pocillo. Incubar a 37 °C durante 5 min. Después de 5 minutos, agregue 1 mL de medio de células endoteliales periventriculares. Transfiera la solución celular a un tubo cónico de 15 mL.
nota: Aquí usamos Accutase para la disociación celular, a diferencia de TrypLE en las secciones 3 y 4.
- Centrifugar las células a 500 x g durante 5 min a temperatura ambiente, aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet de la célula en 1 mL de medio de células endoteliales periventriculares.
- Cuente las células vivas utilizando el método de exclusión de azul de tripano. Células de siembra en placas frescas recubiertas de matriz a una densidad de 1,2 x 105 células/cm2. Incubar a 37 °C y 5% deCO2.
- Almacene las células endoteliales periventriculares humanas mediante criopreservación en medio de congelación (90% de medio de células endoteliales periventriculares y 10% de dimetilsulfóxido [DMSO]).
- Disocie y recoja las celdas siguiendo los pasos 1.3 y 1.4 anteriores. Cuente las células de la solución mediante el método de exclusión de azul de tripano.
- Centrifugar las celdas a 500 x g durante 5 min a temperatura ambiente. Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet celular a 5 x 106 células/mL de medio de congelación.
- Dispensar 1 mL de medio de congelación más células por criovial. Coloque los viales en una cámara llena de isopropanol y enfríe durante la noche a -80 °C a 1 °C/min. Transfiera los viales a un tanque de nitrógeno líquido al día siguiente para almacenarlos a largo plazo.
>2. Preparación de células endoteliales periventriculares humanas para el ensayo
- Permitir que las células endoteliales periventriculares humanas alcancen el 70%-80% de confluencia.
- Disocie las celdas siguiendo los pasos 1.3 a 1.5 como se describe anteriormente. Cuente las células mediante el método de exclusión de azul tripano.
>3. Preparación de interneuronas GABAérgicas humanas para ensayo
NOTA: Las interneuronas GABAérgicas derivadas de células madre pluripotentes inducidas humanas (iPSC) y el medio neuronal se compraron comercialmente (ver Tabla de Materiales). Las neuronas se generan diferenciando una línea de iPSC derivada de fibroblastos humanos siguiendo un protocolo desarrollado por el fabricante. Las células se descongelaron y cultivaron de acuerdo con el protocolo del fabricante.
- Descongele las interneuronas GABAérgicas humanas y cultívelas en una placa de 12 pocillos durante dos semanas hasta una confluencia del 70%-80%.
- El día del ensayo, calentar la solución de disociación celular (ver Tabla de Materiales) y una alícuota de medio neuronal a 37 °C durante 10 min antes de su uso.
- Aspire el medio de cada pocillo que contenga las células. Lave las celdas con 1 mL de PBS estéril 1x por pocillo.
- Separe las células añadiendo 0,5 mL de solución de disociación precalentada por pocillo e incube a 37 °C durante 5 min. Añada 1 mL de medio neuronal por pocillo. Transfiera la solución celular a un tubo cónico de 15 mL. Triturar suavemente para disociar los grupos de células.
- Centrifugar las células a 380 x g durante 5 min a temperatura ambiente, aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet celular en 1 mL de medio neuronal. Cuente las células vivas utilizando el método de exclusión de azul de tripano.
>4. Preparación de células endoteliales humanas de control para el ensayo
>NOTA: Las células endoteliales humanas de control derivadas de iPSC y el medio de células endoteliales se compraron comercialmente (Tabla de Materiales). Estas células endoteliales se generan diferenciando una línea de iPSC derivada de fibroblastos humanos para el destino endotelial siguiendo un protocolo desarrollado por el fabricante. Las células se descongelaron y cultivaron en sustrato de fibronectina de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las placas recubiertas de fibronectina se prepararon siguiendo el protocolo del fabricante.
- Descongele, controle las células endoteliales humanas y cultívelas en una placa de 6 pocillos hasta una confluencia del 80%-90%.
- El día del ensayo, calentar la solución de disociación celular (ver Tabla de Materiales) y una alícuota de medio endotelial a 37 °C durante 10 min antes de su uso.
- Aspire el medio de cada pocillo que contenga las células. Lave las celdas con 1 mL de PBS estéril 1x por pocillo.
- Separe las celdas agregando 0,5 mL de solución de disociación precalentada por pocillo. Incubar a temperatura ambiente durante 5 min. Agregue 1 mL de medio de células endoteliales por pocillo para neutralizar la solución de disociación. Transfiera la solución celular a un tubo cónico de 15 mL.
- Centrifugar las celdas a 200 x g durante 5 min a temperatura ambiente. Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet celular en 1 mL de medio celular endotelial. Cuente las células vivas utilizando el método de exclusión de azul de tripano.
>5. Preparación de insertos de cultivo de un pocillo
- Descongele 1 mg/ml de solución de laminina a temperatura ambiente o toda la noche a 4 °C.
- Cubra un número adecuado de platos de 35 mm con una solución de poli-L-ornitina al 0,01 % (1 ml por plato). Incubar los platos a temperatura ambiente durante al menos 1 h.
- Diluir 1 mg/mL de solución de laminina 1:300 en agua estéril hasta una concentración final de 3,3 μg/mL inmediatamente antes de su uso.
- Aspire completamente la poli-L-ornitina de cada plato. Enjuague bien cada plato 3 veces con agua estéril y aspire completamente para evitar la toxicidad celular inducida por la poli-L-ornitina.
- Añadir 1 mL de solución de laminina de 3,3 μg/mL a cada placa e incubar a 37 °C durante la noche o al menos 1 h. Retire la solución de laminina de la placa inmediatamente antes de usar.
nota: Alternativamente, almacene las placas que contienen lamininas a 4 °C. Equilibre las placas en una incubadora de cultivos celulares a 37 °C antes de usarlas.
- Corte tres lados de un pocillo de un inserto de cultivo de silicona de dos pocillos (Figura 1A) utilizando una cuchilla estéril para generar un inserto de un pocillo (Figura 1B).
nota: Mantenga el inserto de dos pocillos firmemente adherido a la superficie del embalaje original mientras corta para garantizar un corte suave y proteger la adhesividad del inserto.
- Aspire la solución de laminina de los platos.
nota: No lave los platos con PBS estéril o agua después de la incubación de la laminina. Las superficies húmedas evitarán la adherencia ajustada del inserto de cultivo.
- Retire el inserto de un pocillo con pinzas estériles y colóquelo en el centro del plato recubierto de poli-L-ornitina/laminina. Presione a lo largo de los bordes del inserto para fijarlo a la superficie del plato.
- Voltee con cuidado el plato boca abajo para verificar que el inserto esté firmemente adherido.
- Mantenga el plato boca abajo y marque el límite del compartimento del inserto con un rotulador negro permanente con una punta ultrafina (Figura 1C).
>6. Ensayo de migración de cocultivo
- Co-suspender 3 x 104 interneuronas GABAérgicas y 3 x 104 células endoteliales periventriculares humanas en 70 μL de medio de cocultivo (50% medio de mantenimiento periventricular sin GABA y 50% medio neuronal). Siembre esta solución celular dentro del compartimiento de inserto de un pocillo. Prepare un número adecuado de tales platos de ensayo.
nota: No se añadió GABA en el medio de cocultivo para excluir el efecto del GABA exógeno sobre la migración.
- Revise bajo un microscopio para verificar que las células no estén goteando del compartimiento del inserto.
- Agregue lentamente 1 mL de medio de cocultivo a lo largo del costado del plato para evitar que el recubrimiento se seque.
nota: Agregue medio lentamente a lo largo del borde del plato para que el inserto no se altere.
- Como primer control, siembre 3 x 104 interneuronas GABAérgicas humanas solo en 70 μL de medio de cocultivo por inserto de un pocillo. Prepare un número adecuado de tales platos.
- Como segundo control, co-siembra de interneuronas humanas GABAérgicas 3 x 104 con células endoteliales humanas de control 3 x 104 en 70 μL de medio de cocultivo por inserto de un pocillo. Prepara un número adecuado de platos.
- Incubar las placas durante 24 h a 37 °C y 5% deCO2. Después de 24 horas de incubación, revise bajo un microscopio para verificar que las células se hayan adherido correctamente y que no haya fugas.
- Después de 48 h de siembra, retire suavemente el inserto con una pinza estéril. Revise bajo el microscopio para verificar que la capa celular no esté alterada (día 0).
- Retire el medio y agregue 1 mL de medio de cocultivo fresco.
nota: Reserva un número adecuado de platos para adquirir imágenes del día 0.
- Incubar las células durante 5 días a 37 °C y 5% de CO2.
