Todos los procedimientos relacionados con la recolección de muestras se han realizado de acuerdo con las directrices del IRB del instituto.
1. Enchapar las rodajas en los insertos
- Llene cada pocillo de una placa de 6 pocillos con 1.200 μl de medio de cultivo en rodajas. Llene los pocillos no utilizados con 1.200 μl de PBS y llene el espacio central de la placa con 5 ml de PBS 1x. Guarde esta placa a 37 °C.
- Con la herramienta de cuchara ranurada, coloque una rodaja de cerebro en el medio del inserto, empujando suavemente la rebanada para que quede completamente sumergida. Repita para todas las rebanadas.
- Utilice un p1000 para extraer 1 ml de medio de cultivo en rodajas de la parte superior del inserto y dispensarlo en el fondo del pocillo. Retire y deseche el exceso de medios hasta que los bordes de la agarosa alrededor de la rodaja de cerebro se vuelvan visibles. Haz lo mismo con las rebanadas restantes.
- Levante el inserto por el borde con pinzas, incline y retire el exceso de medios. A continuación, transfiera rápidamente el inserto a un plato de 35mm2 que contenga 1 ml de medio de cultivo en rodajas. Use 2 pares de pinzas afiladas para quitar la agarosa alrededor del tejido, teniendo cuidado de no estirar/dañar, cortar o hacer un agujero en la membrana (es más fácil si hace un desgarro en el borde mismo de la agarosa, luego separa la agarosa de ambos lados). Luego, vuelva a mover el inserto a la placa de 6 pocillos y repita para las rodajas restantes.
- En una campana de cultivo de tejidos con el soplador apagado (para evitar que las rodajas se sequen), retire los fragmentos de agarosa de cada membrana.
- Transfiera las rodajas a la placa de 6 pocillos preparada en el paso 1.1 y almacene la placa a 37 °C. Incube las rodajas durante 24-48 horas.
>2. Cambiar el medio de cultivo de la porción
- Repita el paso 1.1 con una placa nueva de 6 pocillos.
- En una campana de cultivo de tejidos con el soplador apagado, transfiera los insertos a nuevas placas de 6 pocillos que contengan medios de corte frescos.
>3. Colocación de células tumorales en el corte
- Sonicar el tinte Cm-DiI y centrifugar a velocidad media durante 2 min.
- Gire las células tumorales que se están utilizando para la superposición a 201 x g durante 5 minutos. A continuación, vuelva a suspender en 2 ml de medio de cultivo en rodajas.
- Añadir 7 μl de Cm-DiI en los 2 ml de células y medios e incubar a 37 °C durante 20 min.
- Gire las celdas a 201 x g durante 5 minutos y vuelva a suspender en 200 μl de medio de corte. Triture suavemente para disociar las células (10-20 veces o hasta que se acabe el pellet) y luego agregue 800 μl de medio de corte para obtener un volumen total de 1,000 μl.
- Cuente las células tumorales viables con azul de tripán. Agregue microesferas fluorescentes verdes a las células tumorales a la misma concentración que las células. Estas microesferas inertes servirán como control. Gire la mezcla de células/microesferas a 201 x g durante 5 minutos y vuelva a suspender en la cantidad deseada de medios de cultivo en rodajas. Células en placa a una densidad de 6.000 células/corte en un volumen de 65 μl. El número de celdas plateadas por sector se puede aumentar en función de las preferencias y la disponibilidad.
- En la campana de cultivo de tejidos, dispense las células en 65 μl de medio/corte en el centro del corte.
