$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Preparación de los AMUMA
>Nota: Los MEAs están compuestos por un sustrato de vidrio, electrodos metálicos microfabricados y una capa de aislamiento de polímero SU-8. A los efectos de este estudio, se ordenaron MEAs disponibles comercialmente con un diseño de guía de electrodos personalizado (Figura 1 A y B). Los 68 electrodos están dispuestos en una rejilla rectangular que está dividida en dos zonas por una ranura de 300 μm de ancho libre de electrodos, cables eléctricos y aislamiento. Cada electrodo tiene un tamaño de 40 x 40 μm y están espaciados 200 μm de centro a centro. Cuatro grandes electrodos de tierra se colocan alrededor del sitio de grabación. Se diferencian de otros MEA estándar disponibles en el mercado en su tamaño (21 mm x 21 mm) y no tienen una cámara de registro fija.
- Para la desinfección, enjuague los MEA con etanol al 100 % (2 veces), etanol al 70 % (1 vez) y agua destilada (2 veces) durante al menos 30 segundos cada uno. Dejar secar. Coloque de 10 a 12 MEA en una placa de Petri de vidrio limpia (150 mm x 25 mm) y cierre la tapa.
- MEAs en autoclave durante 20 min a 120 °C. Almacenar en RT.
- Prepare la solución de recubrimiento (consulte la lista de materiales) para los MEA y almacene las alícuotas a -20 °C.
- Coloque cada MEA en una placa de Petri estéril individual (35 mm x 10 mm).
- Utilice una pipeta enfriada para colocar 150 μl de solución de recubrimiento refrigerada encima de los electrodos y cierre la tapa de la placa de Petri. Después de unos 10 minutos, compruebe si hay burbujas de aire en la parte superior de los electrodos y retírelas suavemente con una espátula cubierta de goma si es necesario. Deje reposar durante 1 hora a temperatura ambiente (RT).
- Aspire los residuos de la solución de recubrimiento, lave 1 vez con un medio optimizado para neuronas prenatales y embrionarias y 2 veces con agua destilada estéril. Si los MEA no se utilizan hasta el día siguiente, manténgalos en agua destilada y estéril a 37 °C en la incubadora durante la noche (O/N). De lo contrario, deje secar directamente en RT.
>2. Ingredientes necesarios para la preparación y el crecimiento de cultivos organotípicos
- Prepare una solución de lavado sin calcio (consulte la lista de materiales).
- Reconstituya el plasma de pollo en solución de lavado (1:1, agite suavemente, evite la formación de burbujas), centrifugue a 3.000 x g durante unos 20 minutos y decante el contenido claro en un tubo estéril. Alícuota 200 μl en criotubos y almacenar a -20 °C.
- Reconstituya la trombina a partir de plasma bovino en consecuencia (200 U/ml) y filtro estéril (filtro de poros de 0,2 μm). Alícuota 200 μl en critotubos y almacenar a -20 °C.
- Para 30 cultivos, prepare 100 ml de medio nutriente (consulte la lista de materiales).
>3. Disección de tejido de la médula espinal
>Nota: El procedimiento produce, dependiendo del número de embriones, cortes de médula espinal para aproximadamente 25 - 35 cocultivos y se prepara dentro de una campana de flujo laminar en condiciones estériles.
- Aplicar una dosis letal de pentobarbital (0,4 ml) a la madre animal mediante inyección intramuscular. Confirme la anestesia profunda comprobando el reflejo de retirada del pedal. Entrega embrionarios de embriones de rata día 14 (E14) por cesárea y sacrificio por decapitación.
- Transfiera los cuerpos de los embriones a una placa de Petri llena de solución estéril y fría para lavar.
- Realice un corte transversal completo con un bisturí por encima de las extremidades traseras y otro por encima de las extremidades anteriores y retire las extremidades del cuerpo. A continuación, haz un corte en el plano frontal para separar las vísceras de la pieza posterior que contiene la médula espinal.
- Para cortar, transfiera las piezas posteriores que contienen la médula espinal una a la vez en un disco de montaje y corte a un grosor de 225 a 250 μm con un picador de teja. Ponga una gota de solución de lavado en el pañuelo picado y transfiera las rodajas con una espátula en placas de Petri de 35 mm x 10 mm llenas de solución de lavado estéril y refrigerada.
- Para cada corte por separado, diseccione la médula espinal lejos del tejido restante. Deje los ganglios de la raíz dorsal adheridos.
- Deje reposar las rodajas durante 1 hora a 4 °C.
>4. Montaje de cortes de tejido de la médula espinal en MEAs
- Calentar el medio nutritivo estéril en la incubadora (37 °C, tapa ligeramente desenroscada para la oxigenación).
- Coloque MEA con pinzas estériles con puntas recubiertas de goma en RT en la placa de Petri bajo un microscopio estereoscópico con la guía de electrodos enfocada. Centre una gota de 6 μl de plasma de pollo en la guía de electrodos limpia, estéril y sin polvo. Con una espátula pequeña, deslice con cuidado dos secciones de la médula espinal con los lados ventrales enfrentados entre sí en la gota de plasma. No toque los electrodos con la espátula.
- Agregue 8 μl de trombina alrededor de la gota de plasma de pollo. Con la punta de la pipeta de trombina, mezcle con cuidado y extienda la mezcla de plasma de pollo/trombina alrededor de las dos rebanadas. Nuevamente, no toque directamente la guía de electrodos frágil. Justo antes de la coagulación, aspire el exceso de plasma/trombina de pollo.
- Tape la placa de Petri para que retenga la alta humedad mientras el conjunto MEA/cultivo permanece durante aproximadamente 1 hora en una cámara humidificada dentro de la incubadora a 37 °C.
- Agregue con cuidado 10 μl de medio nutritivo a la cámara de cultivo, tape la placa de Petri y vuelva a colocarla en la incubadora durante unos 30 minutos.
- Coloque cada conjunto de MEA/cultivo con puntas estériles cubiertas de goma en un tubo de rodillo, agregue 3 ml de medio nutritivo y cierre herméticamente la tapa. Coloque el tubo de rodillo en el tambor de rodillos girando a 1 - 2 rpm en la incubadora en una atmósfera que contenga 5% de CO2 a 37 °C.
- Cambie la mitad del medio nutritivo después de 7 días in vitro (DIV) y luego 1 - 2 veces por semana.
>5. Lesiones mecánicas
- Retire el conjunto MEA/cultivo con puntas estériles cubiertas de goma del tubo del rodillo y colóquelo en una placa de Petri sin medio nutritivo bajo un microscopio estereoscópico con el tejido enfocado. Verifique visualmente que las dos rebanadas estén fusionadas.
- Sujete firmemente el conjunto MEA/cultivo colocando pinzas con puntas cubiertas de goma en el MEA.
- Coloque una hoja de bisturí en la ranura del MEA cerca de las rodajas de tejido. Sostén el bisturí bastante horizontalmente.
- Levante el mango del bisturí, pero deje que la hoja del bisturí permanezca en la ranura del MEA de tal manera que la hoja "ruede" desde la base hasta la punta y, por lo tanto, corte el tejido que cubre la ranura.
- Cortar cualquier conexión de tejido residual con una punta de aguja de 25 G si es necesario. Trabaje solo en el área dentro de la ranura y no toque los bordes sensibles.
- Vuelva a colocar el conjunto MEA/cultivo en el tubo del rodillo. Proporcione 3 ml de medio nutritivo fresco a los cultivos y colóquelos de nuevo en el tambor de rodillos de la incubadora.
>6. Registros electrofisiológicos de la actividad espontánea
- Para investigar la regeneración funcional entre los dos cortes de la médula espinal después del número elegido de DIV, monte el conjunto MEA/cultivo en una cámara de registro en un microscopio y aplique aproximadamente 500 μl de solución extracelular (ver lista de materiales).
- Espere 10 minutos antes de la primera grabación para permitir que el sistema se estabilice.
- Registre la actividad espontánea básica 2x durante aproximadamente 10 minutos de cada electrodo de detección de actividad del MEA en RT.
- Para garantizar condiciones extracelulares estables, intercambie la solución extracelular después de cada sesión de grabación.
