Generación de organoides cerebelosos maduros a partir de células madre pluripotentes inducidas utilizando biorreactores de un solo uso

Resumen

Fuente: Silva, T.P., et al. Generación escalable de organoides cerebelosos maduros a partir de células madre pluripotentes humanas y caracterización por inmunotinción. J. Vis. Exp. (2020)

Este video muestra una técnica para generar organoides cerebelosos maduros a partir de células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) utilizando un biorreactor 3D de un solo uso. El biorreactor facilita la formación de agregados de iPSC, que luego se someten a un tratamiento con una serie de medios de cultivo enriquecidos en factores de crecimiento y quimiocinas que inducen la diferenciación de los agregados de iPSC en organoides cerebelosos maduros. Posteriormente, los organoides se cosechan y se criopreservan para su posterior análisis.

Protocolo

1. Siembra de iPSCs humanas en el biorreactor

1. Incubar iPSCs cultivadas como monocapas en mTeSR1 suplementadas con 10 μM de inhibidor de ROCK Y-27632 (ROCKi). Agregue 1 mL de medio suplementado a cada pocillo de una placa de cultivo de tejidos de 6 pocillos e incube durante 1 h a 37 °C, 95% de humedad y 5% de CO₂.
   nota: ROCKi se utiliza para proteger las iPSC disociadas de la apoptosis.
2. Después de 1 h de incubación, aspire el medio gastado de cada pocillo y lave 1 vez con 1 mL de 1× PBS por pocillo.
3. Agregue 1 mL del medio de desprendimiento de celdas (ver Tabla de Materiales) a cada pocillo de una placa de 6 pocillos e incube a 37 °C durante 7 min hasta que las celdas se desprendan fácilmente de los pocillos con una suave agitación.
4. Pipetear el medio de desprendimiento celular hacia arriba y hacia abajo con una micropipeta P1000 hasta que las células se desprendan y se disocien en células individuales. Agregue 2 mL de medio de cultivo celular completo a cada pocillo para inactivar la digestión enzimática y pipetee las células suavemente en un tubo cónico estéril.
5. Centrifugar a 210 × g durante 3 min y retirar el sobrenadante.
6. Vuelva a suspender el pellet celular en medio de cultivo (es decir, mTeSR1 suplementado con 10 μM de ROCKi) y cuente las iPSC con un hemocitómetro utilizando colorante azul de tripán.
7. Semilla 15 × 10⁶ células individuales en el biorreactor (volumen máximo de 100 mL) con 60 mL de mTeSR1 suplementado con 10 μM de ROCKi a una densidad celular final de 250.000 células/mL.
8. Inserte el recipiente que contiene las iPSC en la unidad base universal colocada en la incubadora a 37 °C, 95% de humedad y 5% de CO₂.
   nota: La agitación del biorreactor se mantiene durante 24 h ajustando el control de la unidad base universal a 27 rpm para promover la agregación de iPSC.

>2. Diferenciación y maduración de agregados derivados de iPSC humanos en organoides cerebelosos

1. Defina el día de siembra de una sola célula como día 0.
2. El día 1, recoja 1 mL de la muestra de agregados de iPSC con una pipeta serológica. Mantenga el biorreactor bajo agitación como antes colocando la unidad base universal con el biorreactor que contiene los agregados en un flujo estéril antes de recolectar la muestra. Coloque la suspensión de la celda en una placa de 24 pocillos de fijación ultrabaja. Compruebe que se forman agregados derivados de iPSC.
3. Adquiera imágenes con un microscopio óptico utilizando un aumento total de 40x o 100x para medir el diámetro del agregado.
4. Mida el área de los agregados en cada imagen utilizando el software FIJI.
   1. Seleccione "Analizar | Establecer medidas" en la barra de menú y haga clic en "Área" y "Aceptar".
   2. Seleccione "Archivo | Abrir" en la barra de menú para abrir un archivo de imagen almacenado. Seleccione la herramienta de selección de línea que se presenta en la barra de herramientas y cree una línea recta sobre la barra de escala que se presenta en la imagen. Seleccione "Analizar | Establecer escala" en la barra de menú.
   3. En "Distancia conocida", agregue la extensión de la barra de escala de la imagen en μm. Defina la "Unidad de longitud" como μm. Haga clic en "Global" para mantener la configuración y en "OK". Seleccione Selección ovalada en la barra de herramientas.
   4. Para cada agregado, delinee el área con la herramienta ovalado. Seleccione "Analizar | Medida". Calcule su diámetro en función del área medida, considerando que los agregados son aproximadamente esféricos utilizando
      
      donde A es el área del agregado.
5. Cuando el diámetro medio de los áridos sea de 100 μm, sustituya el 80% del medio gastado por mTeSR1 fresco sin ROCKi. Cuando los agregados alcancen los 200-250 μm de diámetro, reemplace todo el medio gastado con gfCDM (Tabla 1), dejando que los organoides se asienten en el fondo del biorreactor.
   nota: Si el diámetro medio del árido supera los 350 μm, no inicie el protocolo de diferenciación. Repita la siembra de células individuales. Por lo general, el árido tarda alrededor de 1 día en alcanzar un diámetro medio de 100 μm.
6. Inserte el biorreactor que contiene los agregados en la unidad base universal colocada en la incubadora a 37 °C, 95% de humedad y 5% de CO₂.
7. Disminuya la agitación del biorreactor a 25 rpm.
8. El día 2, repita los pasos 2.2, 2.3 y 2.4 para evaluar el diámetro del agregado. Añadir 30 μL de FGF2 (concentración final, 50 ng/mL) y 60 μL de SB431542 (concentración final, 10 μM) a 60 mL de medio de diferenciación gfCDM (Tabla 1). Sustituya todo el medio gastado del biorreactor por el gfCDM suplementado. Repita el paso 2.6.
   NOTA: SB431542 es crucial para inhibir la diferenciación mesendodérmica, induciendo la diferenciación neuronal. FGF2 se utiliza para promover la caudalización del tejido neuroepitelial.
9. El día 5, repita los pasos 2.2, 2.3, 2.4 y 2.8.
   nota: El tamaño del agregado debe aumentar durante el protocolo de diferenciación. Sin embargo, el diámetro solo es crítico cuando comienza la diferenciación porque este parámetro podría influir en la eficacia de la diferenciación.
10. El día 7, repita los pasos 2.2, 2.3 y 2.4. Diluir FGF2 y SB431542 a 2/3: Añadir 20 μL de FGF2 y 40 μL de SB431542 a 60 mL de medio de diferenciación gfCDM. Reemplace todo el medio gastado del biorreactor con gfCDM suplementado. Repita el paso 2.6 y aumente la agitación del biorreactor a 30 rpm.
11. El día 14, repita los pasos 2.2, 2.3 y 2.4. Añadir 60 μL de FGF19 (concentración final, 100 ng/mL) a 60 mL de medio de diferenciación gfCDM. Sustituya todo el medio gastado del biorreactor por gfCDM complementado con FGF19. Repita el paso 2.6.
    nota: FGF19 se utiliza para promover la polarización de las estructuras del cerebro medio posterior.
12. El día 18, repita los pasos 2.2, 2.3, 2.4 y 2.11.
13. El día 21, repita los pasos 2.2, 2.3 y 2.4. Reemplace todo el medio gastado del biorreactor por medio neurobasal completo (Tabla 1). Repita el paso 2.6.
    nota: El medio neurobasal es un medio basal utilizado para mantener la población de células neuronales dentro del organoide.
14. El día 28, repita los pasos 2.2, 2.3 y 2.4. Añadir 180 μL de SDF1 (concentración final, 300 ng/mL) a 60 mL de medio neurobasal completo. Sustituya todo el medio gastado del biorreactor por un medio neurobasal completo suplementado con SDF1. Repita el paso 2.6.
    nota: SDF1 se utiliza para facilitar la organización de distintas capas de células.
15. El día 35, repita los pasos 2.2, 2.3 y 2.4. Reemplace todo el medio gastado del biorreactor con medio BrainPhys completo (Tabla 1). Repita el paso 2.6.
    nota: BrainPhys es un medio neuronal que apoya a las neuronas sinápticamente activas.
16. Reemplace 1/3 del volumen total cada 3 días con medio BrainPhys completo hasta el día 90 de diferenciación.

Tabla 1: Soluciones de stock y preparación de medios. Se enumeran todos los componentes y volúmenes utilizados para preparar los medios para el protocolo de mantenimiento y diferenciación de las iPSC, así como las soluciones madre de factores de crecimiento y moléculas pequeñas. En el caso de las soluciones madre, se enumeran todas las concentraciones de existencias y los protocolos de reconstitución.

Preparación de medios	mTeSR1 Volumen final: 500 mL	1. Descongele el suplemento mTeSR1 5× a temperatura ambiente (RT) o a 4 °C durante la noche y mezcle con medio basal 2. Almacene el medio mTeSR1 completo a 4 °C durante un máximo de 2 semanas o prepare alícuotas de 40 ml y almacene a -20 °C 3. Precaliente el mTeSR1 completo en RT antes de usarlo
	gfCDM (medio químicamente definido libre de factores de crecimiento) Volumen final: 60 mL	30 mL de jamón F12 30 mL IMDM 600 μL concentrado lipídico químicamente definido (1 % v/v) 2,4 μL de monotioglicerol (450 μM) 30 μL de apotransferrina (solución madre a 30 mg/mL en agua, concentración final: 15 μg/mL) 300 mg de BSA purificada por cristalización (5 mg/mL) 42 μL de insulina (concentración de stock a 10 mg/mL, concentración final: 7 μg/mL) 300 μL P/S (0,5% v/v, 50 U/ml de penicilina/50 μg/ml de estreptomicina)
	Neurobasal Volumen final: 60 mL	60 mL de medio Neurobasal 600 μL N2 suplemento 600 μL Glutamax I 300 μL P/S (0,5 % v/v).
	Completo BrainPhys Volumen final: 60 mL	60 ml de BrainPhys 1,2 ml NeuroCult SM1 Suplemento neuronal 600 μL N2 Suplemento 12 μL BDNF (concentración final: 20 ng/mL) 12 μL GDNF (concentración final: 20 ng/mL) 300 μL Dibuteril-cAMP (concentración de existencias: 100 mg/mL en agua, concentración final: 1 mM) 42 μL de ácido ascórbico (concentración de existencias: 50 μg/mL en agua, concentración final: 200 nM)
Soluciones madre de factores de crecimiento y moléculas pequeñas	Factor básico de crecimiento de fibroblastos (bFGF/FGF2) Concentración de material: 100 μg/mL	1. Reconstituir en 5 mM de Tris, pH 7,6, a una concentración de 10 mg/mL 2. Diluir con 0,1 % de BSA en PBS (v/v) hasta una concentración final de 100 μg/mL
	Factor 1 derivado de células estromales (SDF1) Concentración de material: 100 μg/mL	1. Reconstituir en agua a una concentración de 10 mg/mL 2. Diluir con 0,1 % de BSA (v/v) en PBS hasta una concentración final de 100 μg/mL.
	Factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) Concentración de material: 100 μg/mL<
	Factor neurotrófico derivado de células gliales (GDNF) Concentración de material: 100 μg/mL
	Factor de crecimiento de fibroblastos 19 (FGF19) Concentración de material: 100 μg/mL	1. Reconstituir en fosfato sódico 5 mM, pH 7,4, a una concentración de 10 mg/mL 2. Diluir con 0,1 % de BSA en PBS (v/v) hasta una concentración final de 100 μg/mL
	Inhibidor de ROCK Y-27632 Concentración de stock: 10mM	Reconstituir en DMSO a una concentración de 10 mM.
	SB431542 Concentración de stock: 10mM
	Insulina Concentración de stock: 10 mg/mL	1. Reconstituya 10 mg de insulina en 300 μL de 10 mM de NaOH 2. Agregue con cuidado 1 M de NaOH hasta que la solución se vuelva transparente 3.Llene hasta 1 ml con agua estéril

Tabla 2: Soluciones para la preparación de organoides para criosección e inmunotinción. Se enumeran todos los componentes y volúmenes utilizados para preparar las soluciones utilizadas en la preparación de organoides para criosección e inmunotinción.

Gelatina/Sacarosa Concentración final: 7,5%/15% p/p

1. Pesar 15 g de sacarosa y 7,5 g de gelatina en un frasco de vidrio Schott estéril y mezclar bien 2. Precalentar el PBS 1× a 65 °C 3. Añadir PBS 1× precalentado hasta un peso final de 100 g y mezclar bien 4. Coloque la botella de vidrio Schott en una placa calefactora a 65 °C y agite hasta que la gelatina se derrita 5. Incubar a 37 °C hasta que la solución se estabilice

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Kit BrainPhys Neuronal Medium N2-A y SM1	5793 - 500 ml	Tecnologías de células madre
Concentrado lipídico químicamente definido	11905031	ThermoFisher
BSA purificado por cristalización	5470	sigma
DMEM-F12	32500-035	ThermoFisher
Suero fetal bovino	A3840001	ThermoFisher
Gelatina de piel de vacuno	G9391	sigma
Glutamax I	10566-016	ThermoFisher
Dibutiril cAMP	SC- 201567B -500mg	Frilabo
F12 de Jamón	21765029	ThermoFisher
Línea de iPSC episomal humana	A18945	ThermoFisher	iPSC6.2
IMDM	12440046	ThermoFisher
insulina	91077C	sigma
iPS DF6-9-9T.B		WiCell (Célula Inalámbrica
Isopentano	PHR1661-2ML	sigma
Ácido L-ascórbico	A-92902	sigma
Matrigel	354230	Corning	matriz de membrana basal
Monotioglicerol	M6154	sigma
mTeSR1	85850 -500ml	Tecnologías de células madre
Suplemento de N2	17502048	ThermoFisher
Neurobasal	12348017	ThermoFisher
Paraformaldehido	158127	sigma
PBS-0.1 Recipiente de un solo uso	Referencia: IA-0.1-D-001	PBS Biotech
Unidad base PBS-MINI MagDrive	REFERENCIA: IA-UNI-B-501	PBS Biotech
BDNF humano recombinante	450-02	Peprotech
bFGF/FGF2 humano recombinante	100-18B	Peprotech
FGF19 humano recombinante	Págs. 100-32	Peprotech
GDNF humano recombinante	450-10	Peprotech
SDF1 humano recombinante	300-28A	Peprotech
Inhibidor de ROCK	Y-27632 72302	Tecnologías de células madre
SB431542	S4317	sigma
sacarosa	S7903	sigma
Compuesto Tissue-Tek O.C.T.	25608-930	VWR

)