Aislamiento de células inmunitarias infiltrantes de tumores de un cerebro murino

Resumen

Fuente: Baker, G. J., et al., Lowenstein, P. R. Análisis de Aislamiento y Citometría de Flujo de Células Mononucleares de Sangre Periférica infiltrantes de glioma. J. Vis. Exp. (2015)

El video muestra el aislamiento de células mononucleares de sangre periférica infiltrantes de tumores del cerebro de un ratón utilizando disociación mecánica y digestión enzimática. A esto le sigue la centrifugación en gradiente de densidad para recoger las células inmunitarias para su posterior análisis.

Protocolo

Todos los procedimientos relacionados con la recolección de muestras se han realizado de acuerdo con las directrices del IRB del instituto.

Prepare la solución de mezcla de medios de centrifugación de densidad colocando 90 ml de PBS 10x en 264 ml de agua desionizada ultrapura (3.93x) en un recipiente de plástico estéril. Valorar a pH 7,0-7,2 con HCl y esterilizar por filtro a través de un filtro de 0,22 μm. Conservar a 4 °C.

Prepare medios de centrifugación con una densidad del 70% combinando 18 ml de solución de mezcla de medios de centrifugación por densidad con 30 ml de medios de centrifugación por densidad (consulte la lista de materiales para obtener más detalles) en un tubo de centrífuga de polipropileno de 50 ml. Conservar a 4 °C, pero llevar a RT antes de usar.

Prepare medios de centrifugación de 37% de densidad combinando 9,6 ml de DPBS con 10,4 ml de medios de centrifugación de 70% de densidad en un tubo de centrífuga de 50 ml. Conservar a 4 °C, pero llevar a RT antes de usar.

1. Aislamiento de PBMCs infiltrantes de glioma

1. Con una cuchilla de afeitar limpia y de un solo filo, aísle el área del cerebro que contiene el tumor haciendo un corte sagital en el centro del cerebro para dividir los dos hemisferios. Girar el hemisferio ipsilateral con el lado medial hacia abajo y hacer dos cortes coronales a nivel del cerebelo y el bulbo olfatorio para aislar el tejido diana que contiene el implante tumoral (Figura 1A). También se puede aislar una porción equivalente del hemisferio contralateral y utilizarla como control negativo.
2. Coloque el tejido objetivo en el molinillo de pañuelos de vidrio Dounce etiquetado respectivamente que contiene 1 ml de DPBS, empuje el émbolo completamente hacia abajo y gírelo 7 veces para romper inicialmente el tejido. Levante el émbolo para permitir que el líquido vuelva a depositarse en el fondo del triturador de pañuelos. Repita este paso tres veces; Sin embargo, solo gire el émbolo 4 veces durante las próximas dos repeticiones y 3 veces durante la última repetición para evitar triturar demasiado el tejido.
3. Con una micropipeta P-1000, aplique secuencialmente tres volúmenes de 1 ml de DPBS helado a lo largo de los lados del émbolo para enjuagar en el molinillo de pañuelos.
4. Vuelva a suspender la materia encefálica triturada pipeteándola hacia arriba y hacia abajo y colocándola en un tubo de centrífuga de 15 ml etiquetado con hielo. Enjuague los lados del molinillo de pañuelos Dounce con 1 ml adicional de DPBS helado y agréguelo al mismo tubo de centrífuga de 15 ml. Mantenga todos los tubos que contengan materia encefálica triturada en hielo hasta que se hayan procesado todas las muestras.
5. Una vez que se hayan procesado todas las muestras, centrifugar la materia encefálica triturada en los tubos de centrífuga de 15 ml a 740 x g (RCF máx.) durante 20 minutos a 4 °C.
6. Retirar el sobrenadante con una pipeta serológica de 10 ml y una pistola de pipetas y resuspender la materia encefálica granulada en 1 ml de las enzimas digestivas colagenasa/DNasa-I previamente preparadas con un P-1000. Coloque los tubos de centrífuga de 15 ml en una gradilla para tubos de ensayo y colóquelos en un baño de agua a 37 °C durante 15 minutos.
7. Agite suavemente las muestras dos veces durante el período de incubación moviendo los tubos para facilitar la desagregación del tejido.
8. Añadir 6 ml de DPBS helado con una pipeta serológica de 10 ml a cada tubo para diluir las enzimas digestivas. Pipetea hacia arriba y hacia abajo para volver a suspender y filtra los volúmenes totales a través de filtros estériles de malla de nailon de 70 μm en nuevos tubos de centrífuga de 15 ml etiquetados con hielo.
9. Gire la suspensión de células cerebrales a 740 x g (RCF máx.) durante 20 minutos a 4 °C para obtener un pellet de una sola célula (Figura 1B). Después de retirar los tubos de 15 ml de la centrífuga, colóquelos en hielo y aumente el ajuste de temperatura de la centrífuga a unos 21 °C en preparación para el siguiente paso.
10. Retire completamente el sobrenadante de cada tubo que contenga células cerebrales y vuelva a suspender inicialmente los gránulos en 1 ml de medio de centrifugación de densidad del 70% utilizando una micropipeta P-1000. A continuación, añada 4 mililitros adicionales de medios de centrifugación de 70% de densidad a cada tubo con una pipeta serológica de 10 ml. Enrosque los tapones de forma segura y homogeneice la suspensión de la célula invirtiendo suavemente a los tubos varias veces.
11. Retire los tubos de centrífuga de 15 ml que contienen células cerebrales resuspendidas en medios de centrifugación de 70% de densidad del hielo y colóquelos en una gradilla de tubos de ensayo en RT. Una a la vez, superponga cuidadosamente 2 ml de solución de medios de centrifugación de densidad al 37% sobre los 5 ml de medios de centrifugación de densidad 70% con una micropipeta P-1000 para formar una interfaz limpia entre las dos capas de medios de centrifugación de densidad (Figura 1C).
    1. Utilice un marcador de punta fina para indicar la posición de la interfaz, de modo que pueda identificarse fácilmente después de la centrifugación cuando la distinción sea menos evidente.
12. Gire los tubos de centrífuga de 15 ml a 740 x g (RCF máx.) durante 20 minutos en RT sin interrupción para evitar interrumpir la interfaz.
13. Después de la centrifugación, recoja los PBMC que se han acumulado en la interfaz entre las dos capas de medios de centrifugación de densidad (Figura 1D) introduciendo una micropipeta P-200 en el tubo a lo largo de su lado, evitando con cuidado la capa de lípidos.
    1. Una vez al nivel de la banda PBMC, extraiga lentamente 200 μl de la superficie de la capa de medios de centrifugación de densidad del 70% y colóquelo en un tubo FACS de polipropileno etiquetado respectivamente sobre hielo. Repita una vez para un volumen total de 400 μl por muestra.
14. Añada 3 ml de tampón de flujo a cada tubo FACS que contenga 400 μl de PBMC para diluir suficientemente el medio de centrifugación de densidad, y luego centrifugar las células a 660 x g (RCF máx.) durante 20 min a 4 °C.

Resultados

Figura 1: Aislamiento de PBMC infiltrantes de glioma. (A) Estrategia para la disección de tejido cerebral de ratón que contiene implantes de glioma ortotópico en etapa temprana. El panel superior muestra la bisección sagital del hemisferio ipsilateral lejos del hemisferio contralateral. El panel inferior muestra los dos cortes coronales adicionales necesarios para aislar el tejido ob...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Modificación de Dulbecco de Eagles Medium	Gibco	12430-054	Con 4,5 g/L de D-glucosa, L-glutamina, 25 mM de HEPES y rojo de fenol
Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco	Gibco	14190-144	Sin cloruro de calcio ni cloruro de magnesio
Suero fetal bovino	Omega Científico Inc.	FB-11
Penicilina Estreptomicina	Gibco	Números 15140-122	10.000 U/ml de penicilina; 10.000 μg/ml de estreptomicina
Microtubos cónicos de polipropileno de 0,6 ml	Genesee Científico	22-272
Cubitera de poliuretano	Marca Pescadora	02-591-45	Capacidad: 0,152 onzas (4,5 L)
colagenasa (tipo I-S)	Sigma Aldrich	Hacia 1639	De Clostridium histolyticum
Desoxirribonucleasa I	Corporación Bioquímica de Worthington.	LS002007	>2.000 unidades de Kunitz por mg de peso seco
Tijeras de disección grandes	Ted Pella Inc.	Año 1316
Tijeras de disección pequeñas	FST	14094-11
Pinzas de extremo romo	Ted Pella Inc.	13250
Molinillo de pañuelos de vidrio Dounce de 7 ml	Kontes	KT885300-0007
Medios de centrifugación de densidad Percoll	GE Cuidado de la Salud	GE17-0891-01
Pipetas serológicas de 10 mL	Genesee Científico	12-104	De un solo uso; estéril
Coladores de celdas de malla de nailon estériles de 70 μm	Marca Pescadora	22363548
Tubos de centrífuga de polipropileno de 15 ml	Genesee Científico	21-103	Fondo cónico
Tubos de centrífuga de polipropileno de 50 ml	Genesee Científico	21-108	Fondo cónico
Tubos FACS de polipropileno de fondo redondo de 12x75mm	Marca Pescadora	14-956-1B