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Todos los procedimientos relacionados con la recolección de muestras se han realizado de acuerdo con las directrices del IRB del instituto.
>1. Preparación de instrumentos, medios de cultivo y platos
- Prepare dos tijeras de disección de laboratorio de acero inoxidable y dos pinzas de laboratorio de acero inoxidable. Esterilizar todos los instrumentos en autoclave y colocarlos en una campana de cultivo O/N bajo luz ultravioleta (UV) para su esterilización.
- Prepare 500 ml de medio de cultivo de medios esenciales mínimos (MEM) (10% de suero fetal bovino [FBS], 20 mM de KCl, 25 mM de NaHCO3, 30 mM de D-glucosa, 2 mM de L-glutamina, 100 U/ml de penicilina, 100 μg/ml de estreptomicina y 6 μg/ml de ampicilina) y filtre. Almacenar a 4 °C durante meses.
- Prepare 24 placas de cultivo de pocillos que contengan cubreobjetos de 14 mm de espesor número 1. Esterilizar en autoclave los cubreobjetos y recubrir con 100 mg/L de poli-d-lisina (PDL). La luz ultravioleta esteriliza O/N.
>2. Preparación de soluciones de cultivo de células granulosas cerebelosas (CGC)
- Prepare la "solución A" (100 ml) endH2O estéril, esterilizada en autoclave, tratada con luz ultravioleta, que contiene 250 mg de glucosa, 300 mg de albúmina sérica bovina [BSA], 955 mg de solución salina tamponada con fosfato [PBS] (libre de Ca2+ y Mg+) y 1 ml de MgSOal 3,8% 4·7H2O.
- Preparar la «solución B» (10 ml) que contenga 1 ml de 5 mg/ml de tripsina diluida en 9 ml de solución A.
- Preparar la «solución C» (10 ml) que contiene 1.000 unidades de ADNasa, 0,5 mg de inhibidor de la tripsina de soja, 100 μl de MgSO al 3,8%4·7H2O, diluido a 10 ml con la solución A.
- Preparar la «solución D» (20 ml) que contiene 3,2 ml de solución C, diluida a 20 ml con la solución A.
- Prepare la solución de solución salina equilibrada (EBSS) de BSA/Earle que contiene EBSS, 25 mM de NaHCO3, 3 mM de MgSO4·7H2O y 4% de BSA, pH 7,4.
- Prepare el éster metílico de L-leucina (LME) agregando LME puro en 5 ml de medio de cultivo MEM para obtener una concentración final de 150 mM de LME, devuelva la solución a pH 7.4 usando un medidor de pH de sobremesa y esterilice el filtro usando un filtro de jeringa de poliéter sulfona (PES) de 0.2 μm de 28 mm.
>3. Cultivando los CGCs
- Recoja la cerebela de las crías de rata de 4 a 7 días de edad. Colocar inmediatamente en la placa de Petri que contiene 5 ml de solución A en hielo.
- Vierta el exceso de solución del cerebelo y coloque el pañuelo en la tapa de la placa de Petri.
- Pica el tejido finamente con una cuchilla de afeitar bien flameada en al menos tres direcciones diferentes.
- Agregue el pañuelo picado a la solución B (enjuague la placa de Petri con una solución para asegurarse de que se pierda el tejido limitado) y colóquelo en el baño de agua a 37 °C durante 5 min. Agite suavemente cada dos minutos.
- Añadir la solución D (20 ml) al tubo para neutralizar la tripsina, agitar y centrifugar a 65 x g durante 5 min.
- Vierta el sobrenadante.
- Volver a suspender en 4 ml de solución C. Triturar bien (aproximadamente 10 veces cada una) con tres pipetas de vidrio flameado de diámetro decreciente, hasta que la suspensión sea lo más homogénea posible.
- Agregue lenta y suavemente unas gotas de este homogeneizado sobre el BSA/EBSS. Si comienza a hundirse a través del BSA/EBSS, triture más y/o agregue un poco más de solución C. El homogeneizado debe colocarse en una capa encima del BSA/EBSS. No agitar. Girar a 100 x g durante 5 min.
- Retirar el sobrenadante y volver a suspender el pellet (blando) en 1 ml de medio MEM.
- Cuente las células con un hemocitómetro y una placa a 800.000 células/cubreobjetos en 500 μl de medio MEM. Colocar en una incubadora a 37 °C con 6% de CO2.
- Cambie el medio al día siguiente (24-36 horas después de la preparación). Prepare una solución de medio MEM que contenga 10 μM del inhibidor del ciclo celular arabinofuranosil citidina (AraC).
- Para cada cubreobjetos, conserve 250 μl del medio antiguo en una placa nueva de 24 pocillos, aspire el resto, agregue 250 μl de medio MEM normal y aspire esto para lavar las células. A continuación, añada los 250 μl de medio viejo a las células y rellene con 250 μl de medio que contenga AraC.
nota: Las células se pueden utilizar a partir de los 6 días in vitro (DIV).
>4. Agotamiento selectivo de la microglía (realizado a 6 DIV)
- Agregue LME puro a 5 ml de una alícuota separada de medio MEM para obtener una concentración final de 150 mM de LME.
- Vuelva a poner la solución a pH 7,4 y esterilizar con un filtro de jeringa de poliéter sulfona (PES) de 28 mm y 0,2 μm.
- Diluir la solución a una concentración de 50 mM (2 x LME) en medio MEM y colocarla en un baño de agua a 37 oC durante 10 min junto con medio MEM normal para cultivos de control.
- Retire la mitad (250 μl) del medio MEM de los cultivos de CGC y manténgalo a 37 °C.
- Tratar las células con medio MEM que contenga 2 x LME (250 μl), es decir, diluido 1:1 dando una concentración de pozo de 25 mM, o con medio MEM precalentado sin LME (250 μl) para cultivos de control.
- Incubar las células a 37 °C en una atmósfera humidificada con 6% de CO2 durante 1 hora.
- Lave las celdas dos veces en medio MEM fresco precalentado para eliminar los medios que contienen LME, y luego reemplace el medio de cultivo retenido y un volumen igual de medio MEM precalentado fresco a los pocillos correspondientes.
- Devolver los cultivos a la incubadora (humidificada con 6% de CO2 a 37 °C) y dejar reposar durante 24 horas antes de cualquier tratamiento adicional.