El protocolo para la extracción de tejido cerebral de cachorros de rata Sprague Dawley del día 1, eutanasiados por decapitación, fue aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Alberta.
1. Aislamientos de microglía y astrocitos
NOTA: Todos los medios para aislamiento y cultivo celular se precalientan a 37 °C en un baño de agua. La solución salina equilibrada de Hank (HBSS) tiene un 1% de penicilina-estreptomicina (PS). Todos los medios de Águila modificados de Dulbecco con la mezcla de nutrientes F12 de Ham (DMEM/F12) se complementan con un 10% de suero fetal bovino (FBS) y un 1% de penicilina-estreptomicina (PS). Solo las mezclas con tripsina carecen de FBS. Todos los materiales de este protocolo son estériles (filtro, alcohol, comprado y esterilizado en autoclave) y cada paso posterior al paso número 1.8 se realiza en una cabina de bioseguridad con técnica aséptica.
- Por cerebro, precalentar 15 mL de HBSS y 12,5 mL de DMEM/F12 a 37 °C en tubos de centrífuga cónicos de 50 mL, y aproximadamente 2 mL de tripsina al 0,25% con 1 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) en un tubo de centrífuga cónico de 15 mL. Caliente 25 mL adicionales de DMEM/F12. Caliente la tripsina unos 10 minutos antes de usarla para evitar la pérdida de actividad enzimática.
- Vierta suficiente HBSS tibio en placas de cultivo estériles de 6 y 10 cm para cubrir la superficie. Prepare un plato de 10 cm por cada dos cerebros más un plato adicional de 6 cm.
- Coloque hasta 2 cerebros en cada plato de 10cm2 (Figura 1A).
- Bajo un microscopio de disección, use pinzas curvas y rectas para separar las cortezas a lo largo de la línea media y el cerebelo con el tronco encefálico. Esto produce tres secciones de tejido por cerebro (Figura 1B).
- Pele la capa delgada y semitransparente (meninges) de tejido que contiene vasos sanguíneos de cada sección de tejido y deséchela, transfiriendo el tejido restante a una placa de cultivo separada. Agarre las capas delgadas expuestas por los cortes de tejido, con las pinzas, y tire con cuidado hasta que las partes principales estén "colgando" del tejido cerebral. Finalmente, retire esta porción tirando suavemente. Consulte la Figura 1C-1E para obtener imágenes representativas de antes, durante y después de este paso.
- En un gabinete de bioseguridad, retire el HBSS restante de la placa de cultivo, reteniendo cuidadosamente el tejido. Macerar el tejido con un bisturí y transferir el tejido al tubo precalentado de 15 ml con tripsina.
- Incubar este tubo durante 25 minutos en un baño a 37 °C para digerir el tejido enzimáticamente.
- Centrifugar el tubo a 500 x g durante 2 min a temperatura ambiente y verter el sobrenadante.
- Con una pipeta serológica de 10 mL, añadir 10 mL de DMEM/F12 tibio para inactivar la tripsina y triturar la solución 5 veces para romper el tejido.
- Centrifugar el tubo a 500 x g durante 2 min a temperatura ambiente y verter el sobrenadante.
- Con una pipeta serológica de 10 mL, vuelva a suspender el pellet en 10 mL de DMEM/F12 tibio y transfiera la solución a un tubo de centrífuga cónico de 50 mL.
- Usando una jeringa de 10 mL con una aguja de calibre 18, triture la solución 3 veces.
- Distribuya esta solución en incrementos de 12,5 mL de DMEM/F12 caliente por cerebro.
- Pipetear incrementos de 1 mL de la solución triturada en una placa de 12 pocillos (1 por cerebro).
- Incubar a 37 °C y 5% de CO2 en una incubadora de cultivo celular humidificada. Reemplace los medios después de tres días y actualícelos cada tres días subsiguientes. Después de 2 semanas, las células se pueden recolectar para experimentos.
>2. Síntesis de macrómeros
- Pesar 375 mg de sal de ácido hialurónico (AH) en un tubo centrífugo cónico de 50 mL y añadir 37,5 mL de agua destilada.
- Enjuague la solución con un vórtice durante 1 minuto y sonique la mezcla hasta que parezca homogénea y pierda su viscosidad gelatinosa. Este proceso puede tardar 6 h.
- Transfiera la solución a un vaso de precipitados de 100 ml con una barra agitadora magnética (38 mm) y remueva enérgicamente a temperatura ambiente.
- Valore cuidadosamente 5,0 M de NaOH en el AH de mezcla y mida con papel de pH hasta que el pH se estabilice entre 8 y 12.
- Recoja 3 mL de anhídrido metacrílico fresco (MA, 94%), cubierto por nitrógeno durante el almacenamiento.
nota: MA está expuesto a la atmósfera durante largos períodos (días), perderá su reactividad.
cautela: Todo uso de MA debe realizarse en una campana extractora.
- Añadir 200 μL de MA a la solución de mezcla de AH. La reacción reduce el pH de la solución por debajo de 8.
- Repita los pasos 2.4 a 2.6 hasta que se hayan añadido los 3 mL de MA a la solución. Este proceso puede tardar entre 1 y 2 horas.
- Deje que la reacción continúe durante la noche a 4 °C, sin mezclar.
- Transfiera la solución a 400 mL de etanol frío (EtOH) en un vaso de precipitados de 500 mL y permita la precipitación durante 24 a 72 h a 4 °C.
- Decantar cuidadosamente la mayor parte de la solución en un vaso de precipitados separado para su eliminación y recoja el precipitado en un tubo de centrífuga cónico de 50 mL. Esto se puede distribuir en 2-4 tubos, si es necesario.
- Centrifugar los tubos a 200 x g en una centrífuga durante 2 min a temperatura ambiente y desechar el sobrenadante.
- Rellene el tubo con EtOH frío, mezcle la solución con un vórtice durante 1 minuto y repita el paso 2.10-2.11.
- Añadir 25 mL de agua desionizada estéril, mezclar la solución con un vórtice durante 1 min, sonicar (>20 kHz) durante 1 h e incubar a 4 °C durante la noche.
- Coloque la solución en un congelador a -80 °C durante 15 minutos o hasta que se congele o se congele rápidamente en nitrógeno líquido.
cautela: Cuando use nitrógeno líquido, use guantes protectores, un protector facial y un delantal.
- Liofilizar el tubo (por debajo de 0,1 mBar y -30 °C) durante 24 - 48 h hasta que se produzca un polvo similar a la nieve.
- En este punto, pruebe la pureza de la muestra a través de una resonancia magnética nuclear de 1H, donde se puede confirmar la cantidad de protones de metacrilato (picos de 6,1 y 5,6 ppm), en relación con los protones de metilo (1,9 ppm), en la columna vertebral de HA. Es aceptable una proporción mínima de 95% de metacrilato y protones de metilo.
>3. Formación de gel y encapsulación 3D
- Preparación de cubreobjetos y moldes
- Prepare una solución de agua destilada de 50 mL de metacrilato de propilo al 2% de 3-(trimetoxisilil) en un tubo de centrífuga cónico de 50 mL.
- Coloque cubreobjetos de vidrio de 18 mm en solución y cocine durante 1 h a temperatura ambiente. Se pueden añadir hasta 50 cubreobjetos a la vez.
- Enjuague los cubreobjetos sumergiéndolos en serie en 3 vasos de precipitados con 100 ml de agua desionizada.
- Seque los cubreobjetos al vacío a 40 °C durante la noche con un desecador y un horno.
- Sumerja rápidamente los cubreobjetos individuales en EtOH al 70% con pinzas.
- Sin secar, coloque cada cubreobjetos en un pocillo de una placa de 12 pocillos.
- Lave y aspire cada pocillo con agua desionizada estéril (1 mL por pocillo).
- Añadir 1 mL de poli-L-lisina (PLL) estéril de 2 μg/mL a cada pocillo e incubar durante >2 h.
- Aspire la solución de PLL y deje que los cubreobjetos se sequen al aire.
- Sumerja los moldes de polidimetilsiloxano (PDMS) (consulte la Figura 2) en EtOH al 70% y coloque uno en el centro de cada cubreobjetos, y deje que se seque al aire y cree un sello entre el molde y el vidrio.
- Prepare moldes de PDMS fundiendo reactivos de premezcla de PDMS en una proporción de 10:1 en un plato de poliestireno de fondo plano. La cantidad de PDMS preparada se selecciona para producir una hoja de aproximadamente 1 mm de espesor. Para formar pozos en el PDMS, corte las hojas con un punzón circular con un diámetro interior de 10.
- Preparación de células
NOTA: Todos los pasos del protocolo se realizan con técnica estéril en una cabina de bioseguridad. La solución salina tamponada con fosfato (PBS) se ajusta a pH 7,4 para todos los pasos.
- 24 h antes de la encapsulación celular en ácido hialurónico metacrilato (HAMA), refrescar el medio para los cultivos primarios de 2 semanas (a partir del paso 1.15) en las placas de 12 pocillos. Agregue 1 mL de medio DMEM/F12 (10% FBS y 1% PS) por pocillo.
- Para cada placa de 12 pocillos de celdas, prepare 12,5 mL de tripsina diluida (0,25% de tripsina-EDTA diluido al 30% con medios DMEM/F12) y 25 mL de DMEM/F12 (10% FBS y 1% PS) y caliéntelos a 37 °C en un baño de agua.
- Recoja el medio acondicionado de las placas con una pipeta serológica de 10 mL (> 0,5 mL por pocillo), aspire completamente el líquido restante y reemplácelo con 1 mL por pocillo de tripsina diluida (0.075% de tripsina-etilendiaminácido tetraacético [EDTA]) durante 20-30 min en una incubadora (37 °C, 5% CO2) hasta que la capa de células confluentes se desprenda de la placa.
- Recupere el material de la célula suspendida con una pipeta de 1 mL (aparece como una sola pieza flotante) y recoja en un tubo de centrífuga cónico de 15 mL. Diluir con un volumen equivalente de DMEM/F12 (10% FBS y 1% PS), y centrifugar a 200 x g durante 2 min a temperatura ambiente, desechando el sobrenadante.
- Vuelva a suspender el pellet de celda en 10 mL de DMEM/F12 tibio (10% FBS y 1% PS), triture las celdas 5 veces con una pipeta de 10 mL y centrifugue a 200 x g durante 2 min.
- Decantar el sobrenadante, volver a suspender las células en DMEM/F12 tibio de 5 mL y transferir las células a un tubo de centrífuga cónico de 50 mL.
- Usando una jeringa de 10 mL con una aguja de calibre 18, triture la solución celular 3 veces y filtre la suspensión a través de un tamiz celular de 40 μm en un nuevo tubo de centrífuga cónico.
- Recoja 10 μL de suspensión celular, diluya 1:100 en DMEM/F12 tibio y cuente las células con un contador de células automatizado.
- Incubar en un baño de agua a 37 °C hasta la etapa de encapsulación.
- Encapsulación de celdas
NOTA: Todos los pasos del protocolo se realizan con técnica estéril en una cabina de bioseguridad.
- Por cada placa de 12 pocillos de hidrogeles 3D, caliente 12,5 mL de DMEM/F12 y 12,5 mL de los medios DMEM/F12 acondicionados recogidos durante la preparación de la célula.
- Pesar la cantidad de HAMA requerida para una concentración final de 0.5% en peso/vol. Disuelva este HAMA en PBS filtrado estéril a una concentración de (2% en peso/vol); se utiliza una concentración 4 veces mayor que la concentración final para acomodar la adición de células y otros reactivos. Una placa de hidrogeles de 12 pocillos requiere ~350 μL de PBS con 7 mg de HAMA.
- Soluciones de sonicato (>20 kHz) hasta que HAMA se disuelva por completo durante 60 min.
- Prepare soluciones individuales al 10% de trietanolamina (TEA) y 1-vinil-2-pirrolidinona (NVP), y una solución de 1 mM de eosina Y (EY) en alícuotas de 1 mL de PBS estéril pH 7.4.
- Para una placa de 12 pocillos, haga una mezcla final de 1,4 mL de 1 x 107 celdas, 0,5% en peso/vol de HAMA (350 μL de 2% en peso/vol), 0,1% de TEA (14 μL de 10%), 0,1% de NVP (14 μL de 10%) y 0,01 mM de EY (14 μL de 1 mM) y 20% de mezcla de lámina basal (280 μL de caldo). El volumen restante es PBS.
- Mezcle suavemente la solución y pipetee 100 μL en cada molde de PDMS con una punta de 1 mL.
- Exponga las muestras a una luz LED verde de alta intensidad (~520 nm, 60 mW, en una caja cerrada de 20 cm x 20 cm x 20 cm) durante 5 minutos a temperatura ambiente.
- Agregue 1 mL por pocillo de DMEM/F12 acondicionado en caliente a una placa de 12 pocillos.
- Sujete cada cubreobjetos entre el pulgar y el índice, retire lentamente el molde de PDMS con pinzas curvas teniendo cuidado de no desplazar el gel y colóquelo en un pozo con medio acondicionado.
- Agregue 1 mL adicional de DMEM/F12 tibio a cada pocillo.
- Incubar las placas a 37 °C con 5% de CO2 durante 2 semanas, refrescando los medios celulares cada semana pipeteando 1 mL de medio de cada pocillo y reemplazándolos con 1 mL de DMEM/F12.
