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1. Cultivo celular y preparación de reactivos
- Prepare placas recubiertas para el cultivo celular.
- Diluya la solución de recubrimiento de matriz extracelular (ECM) con medios DMEM/F12 para preparar una solución madre de 1 mg/mL. Alicuente la solución madre de ECM diluida en 30 tubos cónicos de 3 mL cada uno y almacene inmediatamente a -20 °C. Para una solución de trabajo, vuelva a suspender 3 mL de stock de ECM en 33 mL de medio DMEM/F12 preenfriado, llevando el volumen total a 36 mL para una concentración de 80 μg/mL.
- Cubra 1 mL por pocillo de una placa de cultivo celular de 6 pocillos con una solución de trabajo de ECM. Agregue 1 mL adicional de DMEM/F12 por pocillo (si es necesario) para asegurarse de que la superficie del pocillo esté completamente cubierta. Deje reposar las placas de cultivo celular de 6 pocillos recubiertas a temperatura ambiente durante al menos 1 h antes de usarlas.
NOTA: Las placas recubiertas pueden almacenarse en la incubadora o a 4 °C durante un máximo de 2 semanas.
- Prepare formulaciones de medios, factores de crecimiento y moléculas pequeñas.
- Para preparar 500 mL de medio de células madre pluripotentes humanas (hPSC), agregue suplementos de 20x y 500x de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Para preparar 500 mL de medio neural (NM), agregue heparina a una concentración final de 2 mg/mL, 1x de solución antibiótica/antimicótica, 1x suplemento de B27 o 1x suplemento de N2 a un frasco de 500 mL de DMEM/F12 con suplemento de L-glutamina como se detalló anteriormente.
- Para preparar una solución madre de 10 mM (1.000x) de inhibidor de la rho-quinasa Y27632 (Y), agregue 10 mg de polvo en 3 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS). Filtrar, esterilizar, alícuota y almacenar a -20 °C. Utilizar a una concentración de trabajo de 10 μM en medios.
- Para preparar una solución madre de 20 mM (10.000x) de SB431542, agregue 10 mg de polvo en 1,3 mL de dimetilsulfóxido (DMSO). Para preparar una solución madre de 2 mM (1.000x) de DMH1, añada 10 mg de polvo en 13,1 mL de DMSO. Filtre, esterilice, alícuota y almacene cada solución a -20 °C. Utilice cada una a una concentración de trabajo de 2 μM en medios (NM + SB431542 + DMH1).
nota: Este protocolo recomienda concentraciones de trabajo de 2 μM tanto de SB431542 como de DMH1 en función de nuestras observaciones y de los informes de otros que afirman que esta concentración promueve eficazmente la inducción neuronal de las hPSC. También se han reportado concentraciones más altas30. Además, con medios alternativos, también se ha demostrado que las moléculas pequeñas no son necesarias para una alta conversión neuronal. Por lo tanto, las concentraciones de trabajo variarán dependiendo de los entornos de cultivo celular alternativos, y las concentraciones óptimas deben ser probadas por investigadores individuales.
- Para preparar soluciones madre individuales de 100 μg/mL (10.000x) de factor de crecimiento epidérmico (EGF) y factor de crecimiento de fibroblastos-2 (FGF2), añada 1 mg de cada uno en 10 mL de PBS + 0,1% de BSA. Soluciones madre alícuotas de EGF y FGF2 en alícuotas de 50 μL y almacenarlas a -80 °C. Utilizar cada una a una concentración de trabajo de 10 ng/mL en el medio; por ejemplo, agregue 5 μL de EGF y 5 μL de FGF2 a 50 mL de NM (NM + EGF + FGF2).
- Para preparar una solución madre de clorhidrato de doxiciclina (Dox), primero disuelva el polvo en DMSO a 100 mg/ml y almacene a -20 °C. Además, dilúyalo para hacer una solución madre de 2 mg/mL (1,000x) en PBS y almacene a -20 °C. Úselo a una concentración de trabajo de 2 μg/mL en medios; por ejemplo, agregue 50 μL de Dox a 50 mL de NM (NM + Dox).
nota: No vuelva a congelar las soluciones después de descongelarlas.
>2. Generación de Subtipos Neurales a partir de Células Pluripotentes Inducidas Humanas (hPSCs)
NOTA: Todos los cultivos celulares deben mantenerse en una incubadora con 5% de CO2 a 37 °C. Estos cultivos se mantienen a niveles de oxígeno en la habitación, aunque se pueden utilizar niveles más bajos.
- Generar y mantener progenitores de astrocitos (hAstros) a partir de hPSCs.
nota: Esta sección proporciona un protocolo de diferenciación breve y simplificado. Para obtener una descripción detallada (con la formación del cuerpo embrioide, la selección de la roseta y los pasos de modelado regional), consulte el protocolo descrito anteriormente (Figura 1A, cuadro verde punteado).
- Grupos de semillas de hPSC (Figura 1B) en placas de 6 pocillos recubiertas de ECM (ver paso 1.1) con 2 mL de medio hPSC + Y por pocillo. Alimente las células madre todos los días hasta que tengan aproximadamente un 50% de confluentez y se dividan según sea necesario.
- Para dividir las hPSC, agregue 1 mL de reactivo de paso a los pocillos y aspire después de 1 min. Incube las células a temperatura ambiente durante 5 min, agregue 1 mL de medio hPSC y divida los agregados 1:10 en nuevos pocillos recubiertos de ECM en 2 mL de medio hPSC + Y por pocillo.
- Mantenga las células madre hasta que estén aproximadamente en un 50% confluentes, luego cambie el medio a NM + SB431542 + DMH1 para inducir la diferenciación neuronal (día 0). Cuando las celdas sean aproximadamente 95% confluentes, divida 1:6 en nuevos pocillos recubiertos de ECM en el mismo medio.
- El día 14, disocie las células con la solución de desprendimiento y transfiéralas a un matraz no recubierto con Y para promover la formación de agregados.
nota: La adición de Y se utiliza para promover la supervivencia celular y la formación de esferas, pero no se incluye durante cada alimentación.
- Para la generación de progenitores neuronales y neuronas (hNeuronas), utilice estas células de día 14 como se describe a continuación. Alternativamente, utilice estas células en puntos de tiempo posteriores de cultivos monocapa o esféricos antes de que ocurra la maduración neuronal o comience la gliogénesis.
nota: De forma predeterminada, este protocolo produce astrocitos dorsal-corticales. Sin embargo, los subtipos de astrocitos se pueden especificar regionalmente mediante la adición de morfógenos patrón si se desea. El ácido retinoico (AR) puede añadirse para caudalizar las células en fenotipos de la médula espinal, mientras que el erizo sónico (SHH), el agonista suavizado (SAG) o la purmorfamina producirán fenotipos ventrales.
- Para la generación de progenitores de astrocitos y astrocitos en agregados 3D formados espontáneamente (hAstrospheres), cambie a NM + EGF + FGF2 y alimente semanalmente (o según sea necesario para garantizar un pH estable) como se detalló anteriormente.
- Disocie suavemente los agregados de hAstro con la solución de desprendimiento cuando aparezcan centros oscuros y elimine las esferas que se adhieren espontáneamente. Rompa las esferas suavemente una vez a la semana para mantener la salud de las esferas y evitar núcleos necróticos.
nota: No exceder los 5 min de tratamiento con solución de desprendimiento.
- Después de 4-6 meses de expansión, confirme la identidad celular y congele en medio de criopreservación (de acuerdo con las instrucciones del fabricante) o en condiciones de almacenamiento alternativas para la conservación a largo plazo en nitrógeno líquido o utilícelo inmediatamente para la experimentación.
