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Se obtuvieron aprobaciones éticas al realizar los experimentos.
1. Cultivo celular y preparación de reactivos
- Prepare placas recubiertas para el cultivo celular.
- Diluya la solución de recubrimiento de matriz extracelular (ECM) con el medio Modified Eagle Medium/Nutrient Mix F-12 (DMEM/F12) de Dulbecco para preparar una solución madre de 1 mg/mL. Alicuente la solución madre de ECM diluida en 30 tubos cónicos de 3 mL cada uno y almacene inmediatamente a -20 °C. Para una solución de trabajo, vuelva a suspender 3 mL de stock de ECM en 33 mL de medio DMEM/F12 preenfriado, llevando el volumen total a 36 mL para una concentración de 80 μg/mL.
- Cubra 1 mL por pocillo de una placa de cultivo celular de 6 pocillos con una solución de trabajo de ECM. Agregue 1 mL adicional de DMEM/F12 por pocillo (si es necesario) para asegurarse de que la superficie del pocillo esté completamente cubierta. Deje reposar las placas de cultivo celular de 6 pocillos recubiertas a temperatura ambiente durante al menos 1 h antes de usarlas.
nota: Las placas recubiertas pueden almacenarse en la incubadora o a 4 °C durante un máximo de 2 semanas.
- Prepare formulaciones de medios, factores de crecimiento y moléculas pequeñas.
- Para preparar 500 mL de medio de células madre pluripotentes humanas (hPSC), agregue suplementos de 20x y 500x de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Para preparar 500 mL de medio neural (NM), agregue heparina a una concentración final de 2 mg/mL, 1x de solución antibiótica/antimicótica, 1x suplemento de B27 o 1x suplemento de N2 a un frasco de 500 mL de DMEM/F12 con suplemento de L-glutamina como se detalló anteriormente.
- Para preparar una solución madre de 10 mM (1.000x) de inhibidor de la rho-quinasa Y27632 (Y), agregue 10 mg de polvo en 3 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS). Filtrar, esterilizar, alícuota y almacenar a -20 °C. Utilizar a una concentración de trabajo de 10 μM en el medio.
- Para preparar una solución madre de 20 mM (10.000x) de SB431542, agregue 10 mg de polvo en 1,3 mL de dimetilsulfóxido (DMSO). Para preparar una solución madre de 2 mM (1.000x) de DMH1 (4-[6-(4-Isopropoxifenil)pirazolo[1,5-a]pirimidina-3-il]quinoleína, 4-[6-[4-(1-metiletox)fenil]pirazolo[1,5-a]pirimidina-3-il]-quinoleína), añada 10 mg de polvo en 13,1 ml de DMSO. Filtre, esterilice, alícuota y almacene cada solución a -20 °C. Utilice cada una a una concentración de trabajo de 2 μM en medios (NM + SB431542 + DMH1).
nota: Este protocolo recomienda concentraciones de trabajo de 2 μM tanto de SB431542 como de DMH1 en función de nuestras observaciones y de los informes de otros que afirman que esta concentración promueve eficazmente la inducción neuronal de las hPSC. También se han reportado concentraciones más altas. Además, con medios alternativos, también se ha demostrado que las moléculas pequeñas no son necesarias para una alta conversión neuronal. Por lo tanto, las concentraciones de trabajo variarán dependiendo de los entornos de cultivo celular alternativos, y las concentraciones óptimas deben ser probadas por investigadores individuales.
- Para preparar una solución madre de clorhidrato de doxiciclina (Dox), primero disuelva el polvo en DMSO a 100 mg/ml y almacene a -20 °C. Diluirlo aún más para hacer una solución madre de 2 mg/mL (1.000x) en PBS y almacenar a -20 °C. Usar a una concentración de trabajo de 2 μg/mL en medios; por ejemplo, agregue 50 μL de Dox a 50 mL de NM (NM + Dox).
nota: No vuelva a congelar las soluciones después de descongelarlas.
>2. Generación de Subtipos Neurales a partir de Células Pluripotentes Inducidas Humanas (hPSCs)
>NOTA: Todos los cultivos celulares deben mantenerse en una incubadora con 5% de CO2 a 37 °C. Estos cultivos se mantienen a niveles de oxígeno en la habitación, aunque se pueden utilizar niveles más bajos.
- Generar y mantener progenitores de astrocitos (hAstros) a partir de hPSCs.
nota: Esta sección proporciona un protocolo de diferenciación breve y simplificado. (Figura 1A, recuadro verde punteado).
- Grupos de semillas de hPSCs (Figura 1B) en placas de 6 pocillos recubiertas de ECM con 2 mL de medio hPSC + Y por pocillo. Alimente las células madre todos los días hasta que tengan aproximadamente un 50% de confluentez y se dividan según sea necesario.
- Para dividir las hPSC, agregue 1 mL de reactivo de paso a los pocillos y aspire después de 1 min. Incube las células a temperatura ambiente durante 5 min, agregue 1 mL de medio hPSC y divida los agregados 1:10 en nuevos pocillos recubiertos de ECM en 2 mL de medio hPSC + Y por pocillo.
- Mantenga las células madre hasta que estén aproximadamente en un 50% confluentes, luego cambie el medio a NM + SB431542 + DMH1 para inducir la diferenciación neuronal (día 0). Cuando las celdas sean aproximadamente 95% confluentes, divida 1:6 en nuevos pocillos recubiertos de ECM en el mismo medio.
- El día 14, disocie las células con solución de desprendimiento y transfiéralas a un matraz no recubierto con Y para promover la formación de agregados.
nota: La adición de Y se utiliza para promover la supervivencia celular y la formación de esferas, pero no se incluye durante cada alimentación.
- Para la generación de progenitores neuronales y neuronas (hNeuronas), utilice estas células de día 14 para diferenciarse como se describe para las células transgénicas.
- Generar y mantener neuronas inducibles (iNeurons) a partir de hPSCs.
- Semillas de hPSC transgénicas (con un transgén estable de neurogenina 2 inducible por doxiciclina) en placas de 6 pocillos recubiertas de ECM con 2 mL de medio hPSC + Y por pocillo (como se describió anteriormente para líneas no transgénicas). Alimente todos los días con 2 mL de medio por pocillo hasta que estén listos para levantar al 70% de confluencia. Divida las celdas como se describe anteriormente.
- Cuando las células sean aproximadamente un 35% confluentes, agregue NM + Dox para inducir la diferenciación en iNeurons.
nota: Las células se convertirán en progenitores neuronales, pero aún no extenderán las neuritas.
