Generación de esferas de cocultivo en 3D de astrocitos y neuronas para inducir la formación de sinapsis

Resumen

Fuente: Cvetkovic, C., et al. Modelado de Microcircuitos Sinápticos con Cocultivos 3D de Astrocitos y Neuronas a partir de Células Madre Pluripotentes Humanas. J. Vis. Exp. (2018).

Este video muestra un procedimiento para co-cultivar los astrocitos y las neuronas para formar esferas 3D. Estas esferas 3D proporcionan una plataforma distinta para examinar la formación de sinapsis y la integración de redes neuronales, sirviendo así como un modelo potencial para la investigación en neurociencia del desarrollo, enfermedades neurodegenerativas e intervenciones neurofarmacológicas.

Protocolo

>1. Preparación y mantenimiento de cocultivos de esferas 3D

1. Disociar hAstros de los agregados 3D en suspensión.​
   1. Disocie suavemente los agregados de astrocitos humanos (hAstro) con la solución de desprendimiento cuando aparezcan centros oscuros y elimine las esferas que se adhieren espontáneamente. Rompa las esferas suavemente una vez a la semana para mantener la salud de las esferas y evitar núcleos necróticos.
      NOTA: No exceda los 5 minutos de tratamiento con solución de desprendimiento.
2. Disociar hNeuronas o iNeuronas de una monocapa 2D.
   1. Retire el medio de la placa de 6 pocillos y agregue 500 μL de solución de desprendimiento a cada cultivo monocapa que contenga pocillo de hNeuron (neurona humana) o iNeurons (neuronas inducibles). Incubar a 37 °C durante 5 min. Agregue suavemente 2-3 mL de medio basal DMEM/F12 para eliminar las células adheridas.
   2. Recoja las células y los medios en un tubo cónico de 15 ml y centrifuga a 300 x g durante 1 min. Aspire el sobrenadante, añada 1 ml de medio fresco y pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo con una micropipeta de 1.000 μl para lograr una suspensión unicelular.
3. Forme esferas 3D utilizando placas de cultivo de micropocillos.
   1. Prepare la placa añadiendo 0,5 mL de solución de enjuague antiadherente a cada pocillo de la placa de micropocillos. Placa centrífuga a 2.000 x g durante 5 min. Aspirar la solución de enjuague, añadir 1 mL de medio basal DMEM/F12 a cada pocillo a lavar y aspirar de nuevo.
      nota: Asegúrese siempre de que la centrífuga esté equilibrada durante el uso.
   2. Cuente cada tipo de célula con un hemocitómetro o un contador de células automatizado. Agregue la proporción deseada de hAstros y hNeuronas disociadas o iNeuronas a cada pocillo en un volumen total de 2 mL de medio neuronal (NM) + Y (incluya Dox si se utilizan iNeuronas). Centrifugar la placa a 100 x g durante 3 min y devolverla a la incubadora.
      NOTA: Las placas de micropocillos de 24 pocillos (consulte la Tabla de materiales) contienen 300 micropocillos por pocillo. Agregue un mínimo de 6 x 10⁵ celdas (para esferas de 2 x 10³ celdas cada una) y un máximo de 6 x 10⁶ celdas (para esferas de 2 x 10⁴ celdas cada una) en 2 mL de medio por pocillo. Para esferas viables de una densidad específica dentro de este rango, use una cantidad definida de celdas y divida por 300 para calcular el número de celdas por esfera. También se pueden utilizar métodos y herramientas alternativos de formación de esferas si se desea. Siga las instrucciones del fabricante para conocer los rangos aceptables de densidades de celdas.
   3. Permita que las células se autoensamblen en esferas densamente empaquetadas dentro de placas de micropocillos durante los próximos 2 días (Figura 1A). Reemplace el 50% de los medios si el cultivo está amarillento.
      nota: Cambie solo la mitad del medio y pipetee suavemente al quitar y agregar el medio para no alterar las esferas. Las esferas pueden levantarse de los micropozos y fusionarse con mayor fuerza.
   4. Después de 2 días, retire suavemente las esferas de los micropocillos con una micropipeta de 1.000 μL (Figura 2D). Aplique ligeramente fuerza en el fondo de los micropocillos con medios para eliminar cualquier esfera adherida adicional. Deje que las esferas se asienten en un tubo cónico de 15 mL, aspire el medio viejo y agregue el medio nuevo.
4. Configure el sistema de biorreactor de matraz giratorio para formar esferas 3D.​
   1. Limpie la superficie de una placa de agitación magnética con etanol al 70% y colóquela en una incubadora de cultivo celular. Matraces giratorios individuales en autoclave para esterilizar.
   2. Agregue esferas con un mínimo de 50 a 60 mL de medio a cada matraz giratorio (Figura 2D, recuadro). Coloque el matraz en la placa de agitación magnética configurada a 60 rpm. Esferas de cultivo en matraces giratorios hasta que estén listos para la recolección de datos.
      nota: Se necesita un mínimo de 3 semanas en cultivo para la formación de sinapsis.

Resultados

Figura 1: Generación sistemática y reproducible de esferas neuronales 3D de bioingeniería. (A) Las placas de cultivo de micropocillos (μ pocillos) se utilizan para formar esferas neuronales 3D de la densidad deseada y las proporciones de neuronas a astrocitos de una manera sistemática y especificada por el usuario, lo que produce un tamaño y una forma consistentes. Las imágenes se mu...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Placa de 6 pocillos	Fisher Científico	08-772-1B
Tubos cónicos de 15 ml	Plásticos Olympus	28-101
Accutase	sigma	A6964-100ML	Solución de desprendimiento
Placa AggreWell	Tecnologías de células madre	34850
Solución de enjuague antiadherente	Tecnologías de células madre	7010	Evite la adhesión de las células a las placas de micropocillos
Anti/anti	Termopescador	15240062
B27	Termopescador	17504044	Suplemento de medios de comunicación
Medio neuronal BrainPhys	Tecnologías de células madre	5790	Alternativa neurofisiológica al medio basal
DMEM/F12	Termopescador	10565-042	Con el suplemento GlutaMAX
DMH-1	Tecnologías de células madre	73634	PELIGRO: Tóxico si se ingiere. Concentración de trabajo: 2 uM
Suero de burro	Laboratorios Biológicos Lampire	7332100	Concentración de trabajo: 5% en tampón de bloqueo primario, 1% en tampón de bloqueo secundario
Clorhidrato de doxiciclina (dox)	sigma	D3072-1ml	PELIGRO: Tóxico para las mujeres embarazadas. Concentración de trabajo: 2 ug/mL
Factor de crecimiento epidérmico (EGF)	Peprotech	AF-100-15	Concentración de trabajo: 10 ng/mL
Factor de crecimiento de fibroblastos-2 (FGF)	Peprotech	100-18B	Concentración de trabajo: 10 ng/mL
Hemacitómetro o contador automático de células	Tecnologías de la Vida	AMQAX1000
Matriz de membrana Matrigel	Corning	354230	Solución de recubrimiento ECM. Concentración de trabajo: 80 ug/ml. Prepárese en hielo y asegúrese de que las pipetas, los tubos y los medios estén previamente enfriados.
Sistema MEA 2100	Sistemas multicanal	MEA2100
Inhibidor de la rho-quinasa Y27632- (Y)	Tocris	Año 1254	Concentración de trabajo: 10 uM
SB431542	Tecnologías de células madre	72234	Concentración de trabajo: 2 uM
Matraces giratorios	Fisher Científico	4500-125
Frasco de cultivo T25	Plásticos Olympus	25-207	Tapas ventiladas
Azul de tripano	Invitrogen	T10282