Todos los procedimientos relacionados con la recolección de muestras se han realizado de acuerdo con las directrices del IRB del instituto.
1. Preparación de cultivos de ratas MSC
- Recolección de MSCs del fémur
- Autoclave todas las herramientas de disección (es decir, tijeras de disección fina, tijeras de corte de punta roma y pinzas dentadas) a 180 °C durante al menos 2 h antes de su uso.
- Prepare un medio de crecimiento MSC que comprenda un medio esencial mínimo - modificación alfa (αMEM) suplementado con 15% de suero fetal bovino (FBS) y penicilina/estreptomicina (P/S, 1% v/v).
- Sacrificio de ratas Sprague Dawley macho jóvenes (200-250 g de peso corporal) por sobredosis de pentobarbitona (240 mg/kg de peso corporal, intraperitoneal).
nota: Las muestras de médula ósea de diferentes ratas deben procesarse por separado.
- Coloque los animales sacrificados en posición supina. Limpie su abdomen y extremidades inferiores a fondo con etanol al 70%.
- Retire la piel y el tejido subcutáneo sobre la parte medial de los muslos con tijeras finas de disección y fórceps. Retire los músculos del muslo circunferencialmente hasta que el fémur quede expuesto. Continúe esto proximal y distalmente hasta que se vean las articulaciones de la rodilla y la cadera. Desarticule el fémur a través de la articulación de la cadera y la rodilla con unas tijeras de corte de punta roma.
nota: No seccione el fémur para exponer la cavidad de la médula ósea en esta etapa. Transfiera los fémures intactos a una campana de cultivo de tejido de flujo laminar para su posterior procesamiento.
- Use tijeras de corte de punta roma para seccionar los extremos distal y proximal del fémur a través de la metáfisis.
- Coloque un filtro de células de 70 μm sobre un tubo cónico de 50 mL. Inserte una jeringa de 21 G, 10 mL que contenga solución salina tamponada con fosfato (PBS, 10 mM Na2HPO4, pH 7,4) en el canal femoral expuesto y enjuague el contenido de médula en el tubo cónico mediante lavado repetido.
nota: Se utilizan aproximadamente 20 ml de PBS para enjuagar cada fémur. Si el color del contenido enjuagado permanece manchado de sangre y turbio, se puede usar un volumen mayor.
- Recoja las células por centrifugación a 480 x g durante 5 min. Deseche el sobrenadante. Vuelva a suspender el pellet celular en 10 mL de medio de crecimiento MSC. Coloque las células en una placa de cultivo de tejidos de 10 cm. Coloque las placas de cultivo de tejidos en una incubadora de células (37 °C, 5% CO2). Registre el día inicial de enchapado como día 0.
nota: En todos los pasos que impliquen centrifugación, ajuste el freno para una deceleración máxima.
- Establecimiento y expansión de colonias MSC
nota: Este protocolo se basa en la adherencia plástica del cultivo de tejidos para seleccionar MSC desde el interior de la cavidad medular. El contenido de médula ósea se deja adherir al plástico de cultivo de tejidos durante 2 días.
- El día 2, enjuague las placas de cultivo tres veces con 10 mL de PBS para eliminar las células no adherentes. Reemplace el PBS con 10 mL de medio de crecimiento MSC después del enjuague. Lave las células con PBS y recompénelas con el medio de crecimiento MSC cada 3 días.
nota: Las colonias de MSC deberían ser visibles para el día 6-7 (Figura 1A).
- Pase las células el día 10 eliminando el medio de crecimiento y enjuagando las células con PBS. Añadir 1,5 mL de reactivo de disociación de células enzimáticas recombinantes e incubar a 37 °C durante 5 min. Agregue 3 mL de medio de crecimiento MSC para neutralizar la reacción. Recoja las células desprendidas por centrifugación a 250 x g durante 5 min.
- Cuantifique las células dentro del pellet usando un hemocitómetro después de una dilución adecuada en PBS.
- Las células semillas pasaron a una densidad de 40.000 células/cm2 a una placa de cultivo de 10 cm en un medio de crecimiento MSC.
nota: Las MSC de rata deben alcanzar el 80-90% de confluencia dentro de los 2 días posteriores al paso (Figura 1B). Las celdas se pueden pasar como se describe en el paso 1.2.2 para un máximo de 8 pasajes. Las MSCs pueden caracterizarse mediante inmunocitoquímica y su capacidad de diferenciación trilinaje (Figura 2). Solo los cultivos de MSC entre los pasajes 3 y 8 están sujetos a un precondicionamiento hipóxico posterior y al enriquecimiento de los progenitores neurales. Las MSC de mayor número de pasajes adoptan una morfología aplanada (Figura 1C) y no producen suficientes progenitores neuronales. Estos cultivos deben ser descartados.
>2. Preparación de cultivos BMSC humanos
- Diluir 1 mL de aspirado de médula ósea humana con 9 mL de medio de crecimiento MSC y colocar las células en una placa de cultivo de tejidos de 10 cm. Mantener los cultivos en una incubadora de células (37 °C, 5% CO2).
- Retire el medio después de 2 días y enjuague suavemente los cultivos tres veces con 10 mL de PBS para eliminar las células no adherentes. Después del enjuague final, retire el PBS y reemplácelo con 10 mL de medio de crecimiento MSC. Reponga el medio de crecimiento después de cada 3 días de cultivo después del enjuague de PBS.
nota: Las colonias de MSC deberían ser visibles para el día 6-7. El número de colonias puede variar de un sujeto a otro.
- Pase las celdas el día 10, como se describe en el paso 1.2.2. Cuantifique las células dentro del pellet usando un hemocitómetro después de una dilución adecuada en PBS. Siembre las células pasadas a una densidad de 40.000 células/cm2 en una placa de cultivo de 10 cm en un medio de crecimiento MSC.
nota: Las MSC humanas (Figura 1D) muestran una morfología similar a las MSC de rata y deben alcanzar el 80-90% de confluencia dentro de los 2 días posteriores al paso. Deben caracterizarse mediante inmunocitoquímica y su capacidad de diferenciación trilina. Al igual que con las MSC de rata, las MSC humanas entre los pasajes 3 y 8 están sujetas a un precondicionamiento hipóxico posterior y al enriquecimiento de los progenitores neurales.
>3. Precondicionamiento hipóxico
- Desmonte los componentes de la cámara de hipoxia (es decir, la base, la tapa, las bandejas) después de soltar la abrazadera de anillo y limpie las piezas individuales con etanol al 70%. Coloque los componentes de la cámara dentro de una campana de cultivo de tejidos de flujo laminar para la esterilización bajo luz ultravioleta durante 15 minutos.
- Antes del preacondicionamiento hipóxico, retire el medio y enjuague los cultivos de MSC en ratas y humanos (secciones 1 y 2) con 10 mL de PBS. Reemplace el PBS con 10 mL de medio de crecimiento MSC suplementado con 25 mM de HEPES.
nota: Las MSCs cultivadas en placas de 10 cm deben haber alcanzado un 80-90% de confluencia antes de ser sometidas a un preacondicionamiento hipóxico.
- Coloque las placas de cultivo dentro de la cámara de hipoxia. Vuelva a montar los componentes de la cámara y apriete la abrazadera del anillo. Enjuague una mezcla de gases de 99% N2/1% O2 en la cámara a un caudal de 10 L/min durante 5 min.
- Selle los extremos de conexión de la cámara de hipoxia para garantizar que no haya fugas de gas. Coloque la cámara dentro de la incubadora de celdas (37 °C, 5% CO2) durante 16 h.
- Una vez finalizado el preacondicionamiento hipóxico, retire los cultivos de la cámara en preparación para el posterior cultivo de enriquecimiento de progenitores neurales.
>4. Cultivo de enriquecimiento de progenitores neuronales
- Prepare el medio progenitor neural compuesto por el medio de águila modificado de Dulbecco/la mezcla de nutrientes F12 de Ham (DMEM/F12) suplementado con B27 (2% v/v), factor de crecimiento básico de fibroblastos (bFGF, 20 ng/mL), factor de crecimiento epidérmico (EGF, 20 ng/mL) y P/S (1% v/v).
- Separe las MSC hipóxicas precondicionadas de rata/humano, como se describe en el paso 1.2.2. Recoja las células desprendidas por centrifugación a 250 x g durante 5 min. Cuantifique las células dentro del gránulo usando un hemocitómetro después de la dilución adecuada en PBS.
- Vuelva a suspender las células en el medio progenitor neural y siembre en placas de 6 pocillos de baja adherencia a una densidad de 6.000 células/cm2. Colocar el cultivo en una incubadora de células (37 °C, 5% CO2) durante 12 días. Reponer el 75% del medio progenitor neural cada 3 días.
nota: Se deben observar grupos considerables de células no adherentes a los días 6-7. Hacia el día 10-12, se pueden observar neuroesferas con un diámetro ≥ 100 μm (Figura 3). Las MSCs hipóxicas precondicionadas deberían producir más neurosferas que las MSCs cultivadas en condiciones normóxicas.
- Recoja las neuroesferas el día 12 aspirándolas en una pipeta de 10 ml y transfiriéndolas a un tubo cónico de 15 ml. Centrifugar las neuroesferas a 250 x g durante 5 min.
nota: Las neuroesferas se pueden caracterizar en el día 12 para los marcadores progenitores neurales, como la nestina y el GFAP.
5. Generación de células similares a las células de Schwann
- Prepare un medio de inducción glial compuesto por αMEM suplementado con β-heregulina (100 ng/mL), bFGF (10 ng/ml), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF-AA, 5 ng/mL), FBS (10%) y P/S (1% v/v).
- Coloque las neuroesferas preparadas en la sección 4 en placas de 6 pocillos recubiertas de PDL/laminina a una densidad de 5-10 esferas porcm2 en 1,5 mL de medio de inducción glial por pocillo. Reemplace el medio de inducción glial cada 2 días después de enjuagar las células con PBS.
nota: Se observa que las células de las neuroesferas sembradas migran hacia el exterior en el día 2. Para el día 7, las células migratorias tienen una apariencia cónica y deben demostrar inmunopositividad para los marcadores de células de Schwann p75, receptor de neurotrofina (p75) y S100β. Estas células se denominan SCLC.
