Generación de Células de Schwann comprometidas con el destino mediante cocultivo con neuronas DRG
1. Preparación de neuronas DRG de rata purificadas
- Esterilizar en autoclave todas las herramientas de disección (es decir, tijeras de disección, fórceps, dos pinzas de microdisección y tijeras de microdisección) a 180 °C durante al menos 2 h antes de su uso.
- Cubra las placas de cultivo de tejidos de 6 pocillos con poli-D-lisina (PDL, 10 μg/mL en PBS) a 4 °C durante la noche. Retire la PDL y enjuague con 1,5 m de PBS por pocillo.
- Proceda a recubrir las placas con laminina (10 μg/mL en PBS) a 37 °C durante 2 h. Enjuague las placas con 1,5 mL de PBS por pocillo.
- Prepare el medio de mantenimiento neuronal DRG, compuesto por medio neurobasal suplementado con B27 (2% v/v), L-glutamina (1% v/v), factor de crecimiento nervioso (NGF, 20 ng/mL) y penicilina/estreptomicina (P/S, 1% v/v).
- Prepare el medio de purificación de neuronas DRG, compuesto por medio neurobasal suplementado con B27 (2% v/v), L-glutamina (1%), factor de crecimiento nervioso (NGF, 20 ng/mL), P/S (1%), fluorodesoxiuridina (FDU, 10 μg/mL) y uridina (10 μg/mL).
- Sacrificar ratas preñadas en el día 14-15 de gestación por sobredosis de pentobarbital (240 mg/kg de peso corporal, intraperitoneal).
- Coloque los animales sacrificados en posición supina. Limpie su abdomen a fondo con etanol al 70%.
- Cortar longitudinalmente la pared abdominal inferior del animal con tijeras finas de disección y pinzas. Identifique y extraiga el útero con unas tijeras de disección. Cortar la pared uterina para exponer y extraer los embriones. Transfiera los embriones a una placa de cultivo estéril de 10 cm llena de PBS. Coloque el plato de cultivo sobre hielo.
- Transfiera el embrión destinado a la disección a una placa de cultivo estéril de 10 cm llena de PBS (temperatura ambiente) y colóquelo debajo de un microscopio de disección. Tener el embrión en decúbito prono.
nota: La médula espinal blanquecina y los DRG adheridos se pueden ver sobre la cara dorsal del embrión, a través de su piel translúcida.
- Inserte pinzas de microdisección a lo largo de cada lado de la médula espinal y use una disección roma para comenzar a separar la médula espinal del tejido blando circundante. Corte la médula espinal del animal usando pinzas de microdisección a lo largo de la abertura del cuello y el talón de la cola. Realice una disección roma adicional sobre la cara ventral del cordón para liberarlo del tejido blando circundante.
- Utilice pinzas de microdisección para eliminar el tejido blando residual sobre la cara dorsal de la médula espinal liberada.
nota: En esta etapa, solo deben permanecer la médula espinal, las raíces nerviosas y el DRG adjunto.
- Separe los DRG individuales de sus raíces nerviosas conectadas con pinzas de microdisección. Utilice una pluma pipeta conectada a una punta de 1 mL para transferir los DRG a un tubo de centrífuga estéril de 1,5 mL que contenga PBS.
nota: Por cada tubo de 1,5 mL, se puede acomodar un máximo de 100 DRG.
- Centrifugar los GRD a 250 x g durante 5 min y volver a suspenderlos en un reactivo de disociación de células enzimáticas recombinante (200 μL por tubo). Incubar (37 °C, 5% CO2) durante 10 min. Centrifugar los DRG a 250 x g durante 5 min, retirar el sobrenadante y volver a suspender en el medio de mantenimiento de neuronas DRG. Disocie el pellet mediante una trituración suave con una punta de pipeta de 200 μL. Cuantifique las células dentro del pellet usando un hemocitómetro después de una dilución adecuada.
- Siembre las células a una densidad de 5.000 células/cm2 en placas de 6 pocillos recubiertas de PDL/laminina en 1,5 mL de medio de mantenimiento de neuronas DRG por pocillo. Después de dos días de cultivo, retire el medio de mantenimiento de neuronas DRG, enjuague con PBS y reemplácelo con medio de purificación >nota: Para cada ciclo de purificación, trate los cultivos de DRG con un medio de purificación durante 2 días, seguido de 1 día de incubación en un medio de mantenimiento. Después de 3-4 ciclos de purificación, se espera la eliminación de toda la glía endógena. Esto debería tardar aproximadamente 14 días. Los cultivos purificados dan positivo para el marcador neuronal TUJ1 y están ausentes para la expresión de S100β (Figura 1).
>2. Generación de células similares a las células de Schwann
- Prepare un medio de inducción glial compuesto por αMEM (medio esencial mínimo Eagle (MEM), modificaciones alfa) suplementado con β-heregulina (100 ng/mL), factor de crecimiento básico de fibroblastos (bFGF, 10 ng/ml), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF-AA, 5 ng/mL), suero fetal bovino (FBS, 10%) y P/S (1% v/v).
- Coloque las neuroesferas preparadas en la sección 4 en placas de 6 pocillos recubiertas de PDL/laminina a una densidad de 5-10 esferas por cm2 en 1,5 mL de medio de inducción glial por pocillo. Reemplace el medio de inducción glial cada 2 días después de enjuagar las células con PBS.
- NOTA: Se observa que las células de las neuroesferas sembradas migran hacia afuera en el día 2. Para el día 7, las células migratorias tienen una apariencia cónica y deben demostrar inmunopositividad para los marcadores de células de Schwann p75, receptor de neurotrofina (p75) y S100β7. Estas células se denominan SCLC.
>3. Cocultivo de SCLCs con neuronas DRG
- Prepare un medio de cocultivo compuesto por un medio de mantenimiento de neuronas DRG (paso 1.1.4) y un medio de inducción glial (paso 1.2.1) en una relación volumen-volumen de 1:1.
- Prepare el medio de mantenimiento celular Schwann compuesto por la mezcla de medios/nutrientes Eagle Modified Eagle de Dulbecco F-12 (DMEM/F12)) suplementada con FBS (5%), β-heregulina (10 ng/mL) y P/S (1% v/v).
- Retirar el medio de cultivo de las SCLC del día 7, enjuagarlas con PBS e incubarlas con 0,5 mL/pocillo de reactivo de disociación de células enzimáticas recombinantes a 37 °C durante 5 min. Vuelva a suspender las SCLC en el medio de cocultivo.
- Cuantificar las células utilizando un hemocitómetro después de una dilución adecuada.
- Siembrar los SCLCs en cultivos de neuronas DRG purificadas a una densidad de 1.000 células/cm2. Mantener los cocultivos durante 14 días, con reemplazo de medio cada 2 días.
nota: Durante el cocultivo, los SCLC adquirieron la morfología fusiforme que es típica de las células de Schwann maduras (Figura 2). Estas células persisten en su fenotipo tras la retirada de los factores de crecimiento y son capaces de mielinizar axones in vitro e in vivo. La positividad de los marcadores de células de Schwann (es decir, p75 y S100β) debe controlarse mediante inmunofluorescencia.
- Una vez finalizado el cocultivo, el paso de las células de Schwann comprometidas por el destino. Utilice 0,5 mL de reactivo de disociación por pocillo. Cuantificar las células utilizando un hemocitómetro después de una dilución adecuada.
