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1. Desarrollo de las Microcolumnas de Hidrogel de Agarosa
- Prepare una solución de agarosa al 3% en peso/volumen (p/v) pesando 3 g de agarosa y transfiriéndola a un vaso de precipitados estéril que contenga 100 ml de solución salina tamponada con fosfato (DPBS) de Dulbecco. Agregue una barra magnética estéril al vaso de precipitados y colóquela en la superficie de una placa calefactora/agitador. Mantenga el vaso de precipitados tapado para evitar la evaporación de su contenido en el siguiente paso.
- Calentar la agarosa y el DPBS a una temperatura de 100 °C y agitar a 60-120 rpm. Ajuste estos ajustes según sea necesario y controle constantemente la progresión del proceso de disolución a medida que la solución cambia inicialmente de opaca a una apariencia clara que significa que la agarosa se ha disuelto por completo><.
cautela: ¡El vaso de precipitados caliente y la solución están calientes!
- A medida que la solución de agarosa se calienta y agita, recupere cuatro placas de Petri vacías de 10 cm y agregue 20 ml de DPBS a dos de ellas. Coloque agujas de acupuntura (diámetro: 300 μm, longitud: 40 mm), tubos capilares de microlitros de vidrio (diámetro: 701,04 μm, longitud: 65 mm, capacidad: 25,0 μL) y un dispensador de bombillas dentro de la cabina de bioseguridad. Cuando la solución líquida de agarosa se aclare, mantenga un calentamiento constante a aproximadamente 50 °C y agite para evitar la gelificación de la agarosa.
- Introduzca una aguja de acupuntura en la abertura inferior de un dispensador de bombillas. Inserte un tubo capilar sobre la aguja expuesta al exterior. Asegure el tubo capilar introduciendo parte del mismo en la sección de goma del cilindro del dispensador de bulbos.
- Transfiera 1 mL de agarosa líquida con una micropipeta a la superficie de una placa de Petri vacía y coloque un extremo del tubo capilar verticalmente (con la aguja insertada) en contacto con la agarosa, mientras la tapa de goma del dispensador de bulbo se pellizca hacia adentro. Libere lentamente la presión sobre la tapa del dispensador de bulbo para atraer la agarosa al tubo capilar.
nota: La transferencia de la agarosa líquida a los tubos capilares debe realizarse rápidamente. Si la agarosa líquida se deja enfriar en la superficie de la placa de Petri durante un tiempo suficiente (aproximadamente 60 s), comienza a gelificarse, impidiendo la succión adecuada de la agarosa a lo largo del tubo capilar.
- Coloque cada conjunto de bulbo-tubo-aguja en una placa de Petri libre y deje que el gel de agarosa dentro de los tubos capilares se solidifique durante 5 min. Tire con cuidado del tubo capilar con las manos fuera del tapón de goma en el cilindro dispensador de bulbos, dejando la aguja y el gel de agarosa en su lugar dentro del tubo.
- Extraiga manualmente la aguja de acupuntura tirando lentamente de ella fuera del tubo capilar; el cilindro de agarosa recién solidificado también se desliza fuera del tubo en este procedimiento, aún rodeando la aguja. Empuje suavemente la microcolumna a lo largo de la aguja de acupuntura con la punta de unas pinzas estériles para moverla hasta el extremo. Coloque la aguja sobre una placa de Petri abierta que contenga DPBS y empuje la microcolumna en el DPBS con pinzas.
nota: Si la microcolumna de agarosa permanece dentro del tubo capilar de vidrio después de retirar la aguja de acupuntura, empuje lentamente la microcolumna de agarosa fuera del tubo capilar con una aguja de calibre de 25 mm y dentro del plato con DPBS.
- Esterilice los microbisturíes o fórceps con un esterilizador de perlas calientes. Prepare 4 g de agarosa al 4% p/v pesando 4 g de agarosa y transfiriéndola a 100 mL de DPBS. Calentar y remover como se explica en el paso 1.2 para obtener una solución clara de agarosa líquida al 4%. Mantenga el calentamiento y la agitación de la solución a lo largo de los siguientes pasos.
- Transfiera las placas de Petri que contienen las microcolumnas a una campana de disección y mueva una microcolumna con pinzas finas a una placa de Petri vacía. Utilice el estereoscopio para obtener orientación visual y un microbisturí para cortar las microcolumnas a la longitud deseada. Recorte ambos extremos para formar extremos biselados en ángulos de45º con respecto a la horizontal para facilitar el manejo de las microcolumnas durante la adición de la matriz extracelular (ECM) y la células.
- Repita el paso anterior para tres microcolumnas más en la misma placa de Petri y alinee las cuatro construcciones en paralelo con una separación de <3 mm entre cada uno de los cilindros. Cargue 50 μL de solución de agarosa al 4% con una micropipeta y vierta una raya/línea de líquido sobre el conjunto de microcolumnas para conectar y agrupar las construcciones en grupos de cuatro (en lo sucesivo denominados "botes de microcolumnas"). Evite el movimiento de agarosa al 4% hacia los extremos de las microcolumnas, que pueden obstruir el interior, minimizando la distancia entre las construcciones y agregando la agarosa rápidamente en una línea delgada.
nota: No se requieren grupos de cuatro microcolumnas en "botes" para fabricar los andamios astrocíticos. Sin embargo, los barcos sirven para acelerar el proceso de fabricación y para ofrecer una forma más segura de mover y manipular las microcolumnas en etapas posteriores.
- Deje que el bote de microcolumna se enfríe durante 1-2 minutos para permitir la gelificación del 4% de agarosa agregado. Levante el bote de microcolumnas con pinzas finas por la conexión de agarosa al 4% y mueva las microcolumnas a la otra placa de Petri que contenga DPBS preparada en el paso 1.1.3. Fabrica más botes con las microcolumnas restantes según lo desees.
- Traslade las placas de Petri que contienen las microcolumnas y/o botes a una cabina de bioseguridad y esterilícelas con exposición a luz ultravioleta (UV) durante 30 min.
cautela: Use la protección adecuada para evitar la exposición a los rayos UV.
- Almacene las placas con los botes de microcolumna en DPBS a 4 °C, si la adición de ECM y el recubrimiento celular no se producen inmediatamente después, hasta 1 semana. Repita los pasos de fabricación de microcolumnas si las construcciones no se utilizan durante este período de tiempo.
>2. Cultivo y aislamiento de células primarias
- Aislamiento de astrocitos corticales de crías de rata
- En preparación para los siguientes pasos, agregue 20 mL de solución salina balanceada de Hank (HBSS) a cuatro placas de Petri de 10 cm que servirán como depósitos para los tejidos disecados. Mantén todos los platos en hielo. Esterilice las tijeras quirúrgicas limpias, las pinzas, la microespátula y los microbisturíes en un esterilizador de perlas calientes.
- Precalentar tripsina al 0,25% con 1 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) y 0,15 mg/mL de desoxirribonucleasa (DNasa) I en HBSS a 37 °C. Además, precaliente el medio de cultivo de astrocitos a 37 °C, que consiste en el medio Eagle Modificado (DMEM) de Dulbecco con la mezcla de nutrientes F-12 de Ham y un 10% de suero fetal bovino (FBS).
- Anestesiar a las crías de rata Sprague-Dawley después del día 0 o día 1 exponiéndolas a condiciones de hipotermia y eutanasiarlas por decapitación. Sujete la cabeza en una etapa con una aguja de calibre 19 mm colocada en el hocico anterior a los ojos.
- Haz una incisión con un bisturí desde la parte media posterior hasta la anterior, desde la base del cuello hasta justo detrás de los ojos. Realiza otra incisión yendo lateralmente desde justo detrás de los ojos hacia abajo, formando una T. Use pinzas finas para tirar de la piel del cráneo/cráneo hacia un lado.
- Sostenga la cabeza por el hocico (hacia arriba) colocando una punta de las pinzas en la boca del animal y la otra en la superficie exterior. Retire el cerebro con una microespátula estéril y colóquelo en una de las placas de Petri llenas de HBSS frío. Coloque esta placa de Petri en hielo inmediatamente después y en todo momento, excepto cuando esté en uso.
- Coloque un bloque de granito previamente almacenado a -20 °C debajo de un estereoscopio dentro de una campana de disección. Coloque la placa de Petri con el tejido cerebral en la superficie del bloque de granito para preservar su baja temperatura durante el procedimiento de disección. Utilice el estereoscopio como guía visual a lo largo de los siguientes pasos.
- Si los bulbos olfativos permanecen intactos, extráigalos cortándolos con pinzas o microbisturíes. Además, use un microbisturí para extirpar el cerebelo y hacer una incisión en la línea media que separe los dos hemisferios cerebrales. Transfiera los hemisferios con pinzas a una placa de Petri que contenga HBSS fresco y frío.
- Diseccionar las estructuras del mesencéfalo desde el interior de los hemisferios con un microbisturí para obtener solo las cortezas separadas. Use pinzas finas para despegar las meninges, una estructura en forma de lámina, del tejido cortical y para transferir las cortezas aisladas a una nueva placa de Petri con HBSS frío. Utilice el microbisturí para picar el tejido con el fin de aumentar la superficie para la acción de la tripsina en el siguiente paso.
- Utilice una pipeta Pasteur para transferir las cortezas a un tubo de centrífuga de 15 mL que contenga 4 mL de tripsina-EDTA precalentada (8 cortezas en cada tubo). Exponga el tejido cortical a la tripsina-EDTA durante 5-7 min a 37 °C.
- Con una pipeta Pasteur, retire con cuidado la tripsina-EDTA y añada 400 μl de solución de ADNasa I de 0,15 mg/ml al tubo de centrífuga. Agite el tubo o vórtice hasta que todo el tejido se disocie y no queden trozos de tejido en el líquido. Si no es posible disolver completamente el tejido, extraiga los fragmentos restantes con la punta de una pipeta Pasteur.
- Centrifugar el tubo que contiene la solución celular disociada a 200 x g durante 3 min. Eliminar el sobrenadante con una pipeta Pasteur sin alterar las células. Añadir 1 mL de medio de cultivo de astrocitos (definido en el paso 2.1.2) al tubo con una micropipeta y agitar para resuspender y crear una solución homogénea.
- Transfiera 10 mL de medio de cultivo de astrocitos con una pipeta serológica a un matraz T-75. Añada 250 μl de la solución de células de 1 ml (preparada en el paso 2.1.11) con una micropipeta al matraz para colocar una cría de células por matraz. Distribuya la solución celular descargada de manera uniforme por todo el medio de cultivo y agite suavemente el matraz para promover aún más una distribución uniforme.
- Cultive los matraces sembrados en una incubadora humidificada a 37 °C y 5% de CO2. Después de alcanzar 24 y 72 h en cultivo, agitar mecánicamente el matraz para separar los tipos de células no adherentes, como neuronas y oligodendrocitos.
- Después, en cada uno de estos puntos temporales, realice un cambio de medios. Sostenga el matraz verticalmente de modo que el medio de cultivo quede en el fondo del matraz, sin cubrir las células adheridas. Aspire el medio de cultivo con una pipeta Pasteur, presionando la punta de la pipeta contra la esquina inferior del matraz para evitar la extracción de las células. Coloque el matraz en la posición horizontal original y agregue suavemente 10 mL de medio astrocitario sobre las células con una pipeta serológica.
- Devuelva los matraces a la incubadora después de cada cambio de medio. Una vez alcanzado el 90% de confluencia, agite mecánicamente el matraz una vez más para eliminar las células restantes que no se adhieran.
- Pase los astrocitos sacando el medio de cultivo con un vacío y una pipeta Pasteur. Añadir 5 mL de tripsina-EDTA al 0,25% con una pipeta serológica sobre las células adheridas. Agite suavemente el matraz para asegurarse de que la tripsina cubra todas las células, e incube el matraz durante 5-7 minutos a 37 °C y 5% de CO2.
- Apague la tripsina añadiendo 1 mL de medio astrocitario a las células con una pipeta serológica. Extraiga la solución celular del matraz con una pipeta serológica y transfiérala a un tubo de centrífuga estéril de 15 mL. Centrifugar el tubo a 200 x g durante 3 min.
- Retirar el sobrenadante con una pipeta serológica y volver a suspenderlo en 1 mL de medio de cultivo de astrocitos. Agite el tubo para asegurarse de que la solución celular sea homogénea. Cuente el número de células en la solución con un hemocitómetro o un contador automático de células.
nota: Un matraz que es 90% confluente típicamente produce aproximadamente 3 millones de astrocitos.
- Añadir 10 mL de medio de cultivo de astrocitos a un matraz T-75. Realizar una dilución 1:4 transfiriendo 250 μl de la solución celular (paso 2.1.18) con una micropipeta al matraz T-75 que ya contiene medio de cultivo. Agitar suavemente para asegurar una distribución homogénea de las células en toda la superficie del matraz.
- Repita los pasos 2.1.16-2.1.19 cada vez que se logre una confluencia del 90% para pasar las celdas.
- Aislamiento de neuronas corticales de fetos de rata
- Siga preparaciones similares a las de los pasos 2.1.1 y 2.1.2, con la excepción de que el medio precalentado es un medio de cocultivo, que consiste en medio neurobasal + 2% de suplemento de B-27 (para neuronas) + 1% de suplemento sin suero G-5 (para astrocitos) + 0,25% de L-glutamina.
- Aplicar la eutanasia a ratas Sprague-Dawley con asfixia por dióxido de carbono y confirmar la muerte por decapitación.
- Extraiga los fetos de rata y diseccione las cortezas del resto del tejido cerebral en placas de Petri que contengan HBSS en la superficie del bloque de granito enfriado, utilizando un estereoscopio para la guía visual y tijeras esterilizadas, microbisturí y fórceps. Después de la disección sucesiva de las cabezas, cerebros, hemisferios cerebrales y cortezas, transfiera cada tejido a una nueva placa de Petri llena de HBSS.
- Pica el tejido cortical en fragmentos más pequeños para aumentar la superficie de tripsina. Transfiera 4-6 cortezas con una pipeta Pasteur a un tubo con 5 mL de tripsina-EDTA precalentada y manténgalo a 37 °C para disociar el tejido. A los 5-7 minutos, agite manualmente el tubo para mezclar y evitar la formación de grumos en el tejido.
- Retire el tubo a 37 °C después de 10 min. Como se explicó anteriormente en el paso 2.1, extraiga la tripsina-EDTA y sustitúyala por 1,8 mL de solución de ADNasa de 0,15 mg/mL. A continuación, agite el tejido hasta que la solución parezca homogénea, sin fragmentos de tejido flotando en el líquido.
- Centrifugar la solución de tejido disociado a 200 x g durante 3 min. Después de retirar el sobrenadante, volver a suspender en 2 mL de medio de cocultivo. Cuente el número de células en esta solución con un hemocitómetro o un contador automático de células.
nota: El rendimiento habitual es de 3,0-5,0 x 106 células/hemisferio cortical.
- Prepare una nueva solución celular con una densidad de 2,0-4,0 x 105 células/mL en los medios de cocultivo definidos anteriormente.
>3. Desarrollo de los cables astrocíticos dentro de las microcolumnas
- Fabricación de núcleos ECM
NOTA: El ECM debe añadirse al interior de las microcolumnas de hidrogel el mismo día en que se realizará la siembra celular.
- Dentro de un gabinete de bioseguridad, prepare una solución de 1 mg/mL de colágeno tipo I de cola de rata en medio de cocultivo en un tubo de microcentrífuga estéril. Mantenga el tubo de microcentrífuga con la solución de ECM en hielo en todo momento, excepto cuando esté en uso.
- Transfiera 1-2 μL de la solución de ECM con una micropipeta a una tira de papel tornasol para estimar su pH. Añadir 1 μL de hidróxido de sodio (NaOH) o ácido clorhídrico (HCl) 1 N con una micropipeta para aumentar o disminuir el pH de la solución de MEC, respectivamente, y pipetear hacia arriba y hacia abajo para homogeneizar. Verifique el nuevo pH con una tira de papel tornasol y agregue más ácido o base, según sea necesario, hasta que el pH se estabilice en el rango de 7.2-7.4.
- Mueva las placas de Petri del paso 1.2 a una campana de disección y transfiera 4-5 microcolumnas o un bote con pinzas finas estériles a una placa de Petri vacía y estéril de 35 o 60 mm. Utilizando el estereoscopio como guía, sitúe la punta de 10 μL de una micropipeta en un extremo de cada microcolumna y succione para vaciar el lumen de DPBS y burbujas de aire. Confirme la ausencia de burbujas de aire con el estereoscopio para asegurarse de que el ECM agregado en el siguiente paso pueda fluir libremente a través del lumen.
- Cargue una micropipeta P10 con solución de ECM, coloque la punta de 10 μL contra un extremo de las microcolumnas de hidrogel y suministre suficiente solución para llenar el lumen (aproximadamente 3-5 μL), observando la entrada de ECM con el estereoscopio. Pipetear un pequeño depósito (2-4 μL) de solución de ECM en cada extremo de la microcolumna.
nota: Manipule siempre 4-5 microcolumnas o un bote a la vez para evitar el secado prolongado de las construcciones, ya que esto puede resultar en el arrugamiento de la estructura de la microcolumna. Las microcolumnas completamente secas se adhieren firmemente a la superficie de las placas de Petri, lo que impide su utilización para la siembra de células. No se pueden añadir cantidades excesivas de medios de cocultivo (como medida de hidratación) a las microcolumnas, ya que esto puede hacer que la MEC fluya durante el período de incubación que se describe a continuación.
- Pipetea los medios de cocultivo en un anillo alrededor de la placa de Petri para proporcionar un disipador de humedad y evitar que las columnas se sequen durante la incubación. Incubar la placa de Petri que contiene las microcolumnas que contienen ECM a 37 °C y 5% de CO2 durante 1 h para promover la polimerización del colágeno antes de agregar las neuronas y/o astrocitos><.
nota: El ECM debe formar una capa que recubra la superficie interna del lumen hueco, en lugar de un núcleo sólido de ECM que abarque el interior, los cuales se pueden observar con el estereoscopio. Si el ECM forma un núcleo, continúe el período de incubación hasta que solo quede la capa. Con esta capa formada, la solución de células de astrocitos puede llenar el interior de la microcolumna en los pasos de siembra.
- Durante el período de incubación, prepare la solución de células de astrocitos (como se describe a continuación).
- Siembra de astrocitos y neuronas en las microcolumnas
- Paso de los astrocitos plateados (entre el cuarto y el duodécimo paso) como se explica en los pasos 2.1.16-2.1.19. Después de contar el número de células en el matraz, prepare la solución celular a una densidad de 9,0-12,0 x 105 células/mL de solución suspendida en medios de cultivo celular.
- Con un estereoscopio, coloque la punta de una micropipeta P10 en un extremo de las microcolumnas y transfiera suficiente solución celular (~5 μL) al lumen para llenarla completamente. Como se hizo anteriormente con el ECM, agregue pequeños depósitos de solución celular a ambos extremos de cada microcolumna.
- Incubar las microcolumnas plateadas en las placas de Petri a 37 °C y 5% de CO2 durante 1 h para promover la unión de los astrocitos a la MEC. Si no se van a añadir neuronas a las microcolumnas, continúe con el paso 3.2.5.
- Después del período de incubación inicial, añadir 1-2 μL de la solución de neuronas corticales obtenida en el paso 2.2.7 en ambos extremos de las microcolumnas con una micropipeta, mientras observa bajo el estereoscopio. Asegúrese de que haya suficiente medio en los platos para evitar que se sequen, e incube nuevamente durante 40 min a 37 °C y 5% de CO2 para permitir la adhesión de las neuronas><.
nota: La solución de neuronas corticales también se puede agregar 1-2 días después de la formación del haz, realizando el paso 3.2.4 después de eliminar cuidadosamente los medios de cultivo de la placa de Petri con una micropipeta.
- Después del período de incubación, llene cuidadosamente las placas de Petri que contienen las microcolumnas plateadas con 3 o 6 mL de medios de cocultivo para placas de Petri de 35 o 60 mm, respectivamente. Mantener las microcolumnas plateadas en cultivo a 37 °C y 5% de CO2 para promover el autoensamblaje de los haces astrocíticos alineados, que deben formar una estructura agrupada, similar a un cable, después de 6-10 h.