Desarrollo de un modelo 3D de tejido neural polarizado basado en seda y colágeno

Abstract

Fuente: Chwalek, K. et al., Engineered 3D Silk-collagen-based Model of Polarized Neural Tissue.J. Vis. exp. (2015).

Este video muestra la creación de un modelo de tejido neuronal polarizado en 3D utilizando andamios de seda-colágeno. Detalla el proceso de siembra de células neuronales en andamios de seda porosa, la incubación para la unión celular, la incrustación del andamio con colágeno y subraya la importancia de la matriz de colágeno de soporte en la formación de un modelo de tejido neuronal polarizado en 3D.

Protocol

Todos los procedimientos relacionados con la recolección de muestras se han realizado de acuerdo con las directrices del IRB del instituto.

1. Preparación del andamio de seda

1. Preparación de solución de seda a partir de capullos de Bombyx mori
   1. Corta cada capullo en 8 pedazos iguales con unas tijeras. Utilice unos 11 capullos para 5 g de capullos fragmentados. (15 minutos)
   2. Preparar 2 L de solución de 0,02 M Na₂CO₃ y hervir con una placa caliente. (15 minutos)
   3. Pesar 5 g de capullos fragmentados y hervirlos en una solución de Na₂CO₃ durante 30 min. Remover la seda hirviendo cada dos minutos con una espátula. Este paso, llamado desgomado, purifica la fibroína de la seda de las proteínas hidrofílicas, las sericinas. (30 minutos)
   4. Escurre la fibroína a mano y enjuágala con agua destilada al menos tres veces para eliminar los restos de sericina y productos químicos. (5 minutos)
   5. Coloque la fibroína húmeda en una placa de Petri y seque el extracto de fibroína en la campana de flujo O/N.
   6. Al día siguiente, pese la masa seca de fibroína y colóquela en un vaso de precipitados de vidrio. (15 minutos)
   7. Para disolver la fibroína en una solución de LiBr 9,3 M, calcule el volumen necesario (en ml) de LiBr multiplicando la masa de fibroína seca por 4. Vierta lentamente la solución de LiBr sobre la fibroína de seda y use una espátula para sumergir todas las fibras de fibroína. Cubra el vaso de precipitados para evitar la evaporación y colóquelo a 60 °C durante 4 horas para permitir que las fibras se disuelvan. (15 minutos)
   8. Con la jeringa, recoja la solución de fibroína del vaso de precipitados y cárguela en los casetes de diálisis MWCO 3.500. Realizar diálisis con agua destilada durante 48 hr. Cambia el agua cada dos horas.
   9. Con la jeringa, recoja la solución de fibroína de los casetes en tubos cónicos de 50 ml y centrifugue dos veces a 9.000 rpm (~12.700 x g) a 4 °C durante 20 min. Después de cada paso de centrifugación, vierta el sobrenadante en un tubo nuevo y deseche el pellet. (40 minutos)
   10. Mida la concentración de la fibroína estimando el peso seco. Vierta 1 ml de solución de seda en un bote de pesaje. Secar la muestra en el horno a 60 °C durante 2 horas. Pesar la fibroína de seda seca y calcular la concentración de la solución de fibroína de seda multiplicando el peso obtenido por 100. La concentración esperada de solución de seda es de 6-9% (p/v).
   11. Ajuste la concentración de seda al 6% (p/v) diluyéndola en agua destilada.
       Punto de parada: La fibroína de seda líquida puede almacenarse a 4 °C hasta un mes en un recipiente cerrado.
2. Preparación de andamios porosos a partir de solución de seda.
   1. Tamizar el NaCl granular para separar los gránulos de 500-600 μm, que se utilizarán en pasos posteriores. Deseche los gránulos con un tamaño inferior a 500 μm y superior a 600 μm. (15 min)
   2. Vierta 30 ml de solución de seda al 6% en el molde de politetrafluoroetileno (PTFE) (Figura 1). Esparcir suavemente 60 g de NaCl tamizado sobre la seda. Golpee el recipiente para obtener una capa uniforme de sal. Incubar 48 horas en RT para polimerizar la seda.
   3. Coloque el molde de PTFE que contiene andamio en el horno a 60 °C durante 1 hora para finalizar la polimerización y evaporar el líquido restante.
   4. Coloque el contenido del molde de PTFE en un vaso de precipitados que contenga 2 L de agua destilada durante 48 horas para lixiviar la sal. Cambia el agua 2-3 veces al día. Retire los andamios de esponja de los moldes cuando la sal se haya lixiviado por completo.
      Punto de parada: Las esponjas se pueden almacenar sumergidas en agua a 4 °C en un recipiente cerrado para evitar la deshidratación de los andamios.
   5. Corte los andamios con un punzón de biopsia de 5 mm de diámetro cuando esté listo. Precorte los andamios para que alcancen unos 2 mm de altura. Perfore el centro del andamio con el punzón de biopsia de 2 mm de diámetro (Figura 2A). (1 hora)
   6. Autoclave los andamios sumergidos en agua para esterilizarlos (ciclo húmedo, 121 °C, 20 min).
      Punto de parada: Las esponjas se pueden almacenar sumergidas en agua a 4 °C en un recipiente cerrado para evitar la deshidratación de los andamios.
   7. Antes de la siembra celular planificada, sumerja los andamios en una solución estéril de poli-D-lisina (PDL) de 0,1 mg/ml. Incubar durante 1 hora a 37 °C.
   8. Lave los andamios 3 veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS) para eliminar el PDL no unido. (30 minutos)

>2. Aislamiento de neuronas corticales de rata

1. Diseccionar las cortezas de ratas Sprague-Dawley embrionarias de día 18 (E18) después de obtener el protocolo animal aprobado. (2 horas)
2. Incubar 10 cortezas en 5 ml de tripsina al 0,25% con DNasa I al 0,3% (de páncreas bovino) durante 20 min a 37 °C.
3. Inactiva la tripsina añadiendo 1 mg/ml de proteína de soja.
4. Triturar las cortezas con una pipeta Pasteur de 10 ml pipeteando hacia arriba y hacia abajo 20 veces hasta generar una suspensión unicelular. Sea suave y evite la formación de burbujas de aire. (10 minutos)
5. Centrifugar la suspensión celular a 127 x g durante 5 min.
6. Vuelva a suspender el pellet celular en 10 ml de medio de cultivo (medio neurobasal, 1x suplemento de B27, 1x Glutamax, 1% de penicilina/estreptomicina). Cuenta las celdas. La concentración celular esperada es de aproximadamente 2x10⁷/ml. (20 min)

>3. Ensamblaje de construcción y cultura

1. Siembra de andamios con celdas
   1. Mueva los andamios estériles y todos los utensilios necesarios dentro de una campana de cultivo celular. Coloque los andamios en una placa de cultivo celular de 96 pocillos utilizando pinzas estériles, asignando un andamio por pocillo. (10 minutos)
   2. Sumerja los andamios en el medio de cultivo celular para equilibrarlos antes de la siembra celular. Incubar durante 1 hora a 37 °C. (10 min)
   3. Aspirar el exceso del medio de los andamios.
   4. Aplique 100 μl de suspensión celular/andamio. (10 minutos)
   5. Incubar las células a 37 °C O/N para permitir la unión de las células al andamio.
   6. A la mañana siguiente, aspire las células no adheridas y aplique 200 μl/pocillo de medio de cultivo fresco. (10 minutos)
2. Andamio incrustado con matriz de colágeno. (2 horas)
   1. Coloque 10x PBS, agua, 1 N NaOH y colágeno de cola de rata I en hielo. Prepare una solución de trabajo de colágeno según las instrucciones del fabricante. Manténgalo en hielo hasta que las construcciones sembradas con células estén listas (hasta 1 hora).
   2. Retire las construcciones de seda con semillas de células de la incubadora y aspire el exceso de medio.
   3. Transfiera los andamios a los pocillos vacíos en la placa de pocillos con pinzas estériles y sumerja cada andamio en 100 μl de solución de colágeno de 3 mg/ml. Vuelva a colocar la placa de cultivo de tejidos en la incubadora durante 30 minutos para permitir la polimerización del colágeno.
   4. Aplicar 100 μl de medio/pocillo de cultivo celular precalentado. Cultive las construcciones durante una semana, cambiando el medio todos los días reemplazando solo la mitad del volumen del medio.

Results

Figura 1. Molde de PTFE utilizado para la preparación de andamios de esponja de seda. Las dimensiones: 10 cm de diámetro, 2 cm de altura.

Figura 2. 3D modelo de tejido similar al cerebro. (A) Andamio de esponja de seda porosa. (B) Tin...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
centrífuga 5804 R	Eppendorf
poli-D-lisina	Sigma-Aldrich	P6407-5MG	Concentración final 10 μg/ml, disuelto en agua
Medio neurobasal	Gibco	21103049	calentar hasta 37 °C antes de usar
Suplemento B27 50x	Gibco	17504-044
Glutamax	Gibco	35050-061
Penicilina Estreptomicina	Corning	30-002-CI
Colágeno I, cola de rata, 100 mg	Corning	354236	Concentración final 3 mg/mL
NaOH	Sigma-Aldrich	S2770	corrosivo
Pbs	Sigma-Aldrich	D1283-500ML
Na2CO3	Sigma-Aldrich	223530
Libr	Sigma-Aldrich	213225
Casetes de diálisis MWCO 3500	Termo Fisher	66110
Placa calefactora	Fisher Científico	Isotemp
cerner	Fisher Científico	Nº 270, Nº 35, Nº 30
Ptfe			molde hecho en casa (Figura 1) 10 cm de diámetro, 2 cm de altura
NaCl	Sigma-Aldrich	71382
Punzón de biopsia 5 mm	Instrumento de precisión mundial	501909
Punzón de biopsia 2 mm	Instrumento de precisión mundial	501908
tripsina	Sigma-Aldrich	T4049-500ML
DNasa	Roche	10104159001	Concentración final 0,3%
Proteína de soja	Sigma-Aldrich	T6522-100MG	Concentración final 1 mg/ml