$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Período de diferenciación antes del rechapado
- Diferenciar las neuronas en placas de 10 cm, utilizando un protocolo de elección, hasta que las neuronas hayan formado una red gruesa con sus procesos y expresen no solo marcadores neuronales tempranos como MAP2 o TuJ1, sino también marcadores tardíos como NeuN.
- Cambie la mitad del medio de elección cada 4 días durante el proceso de diferenciación neuronal.
nota: Los cambios de medio más extensos o frecuentes diluyen los factores tróficos esenciales y podrían desfavorecer la maduración.
- Para las neuronas WT126 derivadas de iPSC, utilice los siguientes medios de cultivo posteriores a la diferenciación: 5 mL de suplemento 100x N2 (neural), 10 ng/mL de factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), 10 ng/mL de factor neurotrófico derivado de línea celular glial (GDNF), 1 μg/mL de laminina, 200 μM de ácido ascórbico, 1 μM de dibutiril-cAMP y 10 mL de SM1 para 500 mL de mezcla de medio/nutriente de Eagle modificada de Dulbecco F-12 (DMEM/F12). Gradualmente, utilizando cambios de medios medios, reemplácelos con medio basal neural (Tabla de Materiales) y los mismos suplementos.
- Para las células madre pluripotentes inducidas o las neuronas CVB WT derivadas de iPSC, utilice el siguiente medio de cultivo posterior a la diferenciación: 500 mL de medio A basal neural (Tabla de Materiales) y 500 mL de medio DMEM/F12 con 2 μg/mL de laminina, 10 mL de suplemento de glutamina (Tabla de Materiales), 0,75 mg/mL de bicarbonato de sodio, 5 mL de aminoácidos no esenciales del medio esencial (MEM) mínimo, 0,2 mM de ácido ascórbico, 10 ng/mL de BDNF, 20 mL de B27 50x y 10 mL de suplemento de N2 100x.
>2. Recubrimiento de multipozos
- El día antes de recubrir, cubra con poli-L-ornitina (PLO). Disuelva el PLO en agua estéril para hacer una solución madre (10 mg/mL). Almacene este caldo a -20 °C. Diluya PLO 1:100 en agua para obtener una concentración de 50 μg/mL cuando se recubre vidrio y una proporción de 1:1.000 (10 μg/mL) cuando se recubre plástico.
- Aplique el recubrimiento directamente a las placas de destino. Utilice el volumen de recubrimiento adecuado para el tamaño de la placa (es decir, para una placa de 24 pocillos, aplique 500 μL de solución de PLO por pocillo).
- Deje reposar los platos en la oscuridad durante la noche a temperatura ambiente.
- Recupere las placas recubiertas el día de la rechapado y transfiéralas a un gabinete de bioseguridad estéril.
- Aspire la solución de PLO y enjuague dos veces con agua estéril.
- Laminina diluida (1,15 mg/mL) en solución salina tamponada con fosfato (PBS) con una dilución de 1:400.
nota: Descongele la laminina a 4 °C y agréguela rápidamente al PBS para evitar la agregación de laminina y el recubrimiento desigual.
- Aspirar agua estéril y aplicar 500 μL de recubrimiento de laminina a los pocillos previamente recubiertos con PLO.
- Coloque las placas en una incubadora a 37 °C durante un mínimo de 4-6 h. Utilice incubaciones más largas, de hasta 16 h, para superficies de vidrio. Utilice tiempos de incubación constantes.
>3. Replaticado de neuronas diferenciadas
- Enjuague la placa de neuronas diferenciadas con PBS una vez suavemente. Disperse el PBS suavemente por la pared de la placa, y no directamente sobre las células, para evitar alterarlas.
- Aspire suavemente el PBS, teniendo cuidado de evitar tocar las células directamente, pero aspire desde el borde de la placa mientras la inclina hacia el investigador.
- Aplique un mínimo de 1 mL de la enzima proteolítica (Tabla de Materiales) por placa de 10 cm y devuelva las células a la incubadora. Agregue volúmenes ligeramente más altos si la sala de cultivo de tejidos exhibe una alta tasa de evaporación debido a la baja humedad.
- Incubar las células con la enzima proteolítica durante 40-45 min para separarlas de la placa y separarlas de otras neuronas dentro de la red neuronal.
nota: El tiempo en este paso es crítico. El enfriamiento de la proteasa demasiado pronto puede provocar un aumento de la muerte celular después del replateado. El fabricante de la enzima proteolítica recomienda que se utilicen temperaturas muy inferiores a 37 °C con períodos de incubación más largos para el paso de las líneas celulares (por ejemplo, durante la noche a 4 °C). Sin embargo, debe evitarse la manipulación de neuronas a 4 °C, ya que a menudo muestran una mala supervivencia después de la exposición al frío. El fabricante también afirma que una incubación de 60 minutos con la enzima a 37 °C conduce a su inactivación enzimática. Sin embargo, en la experiencia de los autores, una incubación de 40-45 minutos de cultivos neuronales derivados de hiPSC a 37 °C es suficiente para una disociación eficiente y una excelente supervivencia neuronal tras el replaticado.
- Revise las neuronas en un microscopio de contraste de fase durante el tiempo de incubación y permita que el tratamiento con proteasa continúe hasta que la red neuronal se desprenda completamente de la placa y comience a romperse en láminas más pequeñas al agitar brevemente la placa bajo el microscopio.
- Apague la actividad de la proteasa utilizando 5 mL de medio DMEM fresco por 1 mL de proteasa en la placa de 10 cm para detener la digestión. Triture suavemente las células contra la placa de 5 a 8 veces para interrumpir la red, utilizando pipetas serológicas. Tenga cuidado de no aplicar demasiada presión al triturar, ya que las neuronas diferenciadas son frágiles. No utilice una punta P1000, ya que el extremo es demasiado afilado y estrecho y, por lo tanto, puede cortar o dañar las neuronas.
- Aplique la solución con células a través de un colador de células con malla de 100 μm de diámetro en un tubo cónico fresco de 50 mL gota a gota.
- Enjuague el colador con 5 ml adicionales de medio DMEM fresco, después de que las células se hayan filtrado.
- Centrifugar las células en una centrífuga de sobremesa a 1.000 x g durante 5 min.
- Regrese el tubo cónico a la cabina de bioseguridad y aspire la mayor parte del medio, dejando alrededor de 250 μL para garantizar que las células retengan la humedad.
- Vuelva a suspender las células suavemente en 2 ml de medio DMEM fresco. No pipetee el pellet contra el costado del tubo. En su lugar, invierta suavemente el tubo cónico 2-3 veces y pase las células a través del extremo de una pipeta serológica de 5 ml para desalojarlas.
- Aplique 10 μL de neuronas resuspendidas en el borde de un hemocitómetro.
- Agregue 8-10 μL de azul de tripán a la gota de células para evaluar la viabilidad celular durante este paso de resuspensión. Aplique 10 μL de esta mezcla al hemocitómetro u otros contadores automáticos de células. Evaluar como viables aquellas células que son de fase brillante y excluir el colorante azul de tripano.
- Determine la cantidad de células viables/mL y prepárese para diluir el contenido del tubo cónico de acuerdo con la densidad celular deseada.
- Placa ~10,000 celdas por pocillo para una placa de 384 pocillos; placa ~150,000-200,000 celdas por pocillo para una placa de 24 pocillos.
- Añada DMEM fresco al tubo cónico de las células resuspendidas para lograr la dilución adecuada y añada suplementos adicionales apropiados como B27 y/o BDNF, en función de los requisitos de la línea celular específica.
- Incline suavemente el tubo cónico para mezclar 2-3 veces.
- Aspire el recubrimiento de laminina de la placa de 24 pocillos o de la placa de pocillos múltiples de 384 pocillos con una pipeta de 16 canales y enjuague una vez con PBS.
- Aspire PBS con un P1000 para la placa de 24 pocillos o la pipeta de 16 canales para placas de 384 pocillos.
- Aplique la solución celular a cada pocillo en un movimiento en forma de ocho para evitar la aglomeración. La uniformidad del recubrimiento también se puede optimizar mediante el uso de dispositivos automatizados de manejo de líquidos.
nota: La adición de laminina al medio a partir de 2-4 días después de la resiembra también ayuda a mantener una distribución homogénea de las células.
- Repita los pasos 3.19 y 3.20 para cada pocillo.
- Regrese la placa a la incubadora, ajustada a 37 °C y 5% de dióxido de carbono.
- Después de 2 días, comience a cambiar la mitad del medio cada 4 días utilizando los medios de cultivo posteriores a la diferenciación descritos en la sección 1.2.