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1. Fabricación de moldes SU-8 por fotolitografía
>NOTA: Este procedimiento involucra productos químicos peligrosos. Use una campana extractora y EPP en todo momento.
- Limpie la oblea de silicona (4 pulgadas de diámetro, 1 mm de grosor, pulida) con acetona y sople con gas nitrógeno. A continuación, hornee a 180 °C durante 3 minutos para que se seque.
- Dispensar 3 mL de SU-8 2100 en una oblea limpia.
- Cubra el SU-8 uniformemente sobre la oblea con un recubridor giratorio a 500 rpm durante 10 s y luego, gire secuencialmente a 1500 rpm durante 30 s con una aceleración de 300 rpm/s para obtener una capa de 150 μm de espesor de SU-8.
NOTA: Asegúrese de que la oblea de silicona esté colocada en el centro del recubridor giratorio y correctamente fijada por vacío.
- Hornee suavemente la oblea en la placa calefactora a 50 °C durante 10 minutos, a 65 °C durante 7 minutos y a 95 °C durante 45 minutos.
- Ajuste la fotomáscara (Figura 1) al alineador de máscaras y exponga la luz ultravioleta (365 nm) durante 60 s.
NOTA: El tiempo de exposición debe optimizarse con una dosis adecuada de luz ultravioleta.
- Después de la exposición, hornee la oblea a 65 °C durante 6 minutos y a 95 °C durante 13 minutos en la placa caliente.
- Revele la oblea durante 10-20 min en revelador SU-8 con agitación utilizando un agitador orbital, cambiando la solución de revelado una vez durante el proceso.
NOTA: Extienda el tiempo de desarrollo cuando permanezcan los restos de SU-8.
- Enjuague la oblea con isopropanol y seque suavemente la oblea con gas nitrógeno.
- Mida la altura del SU-8 depositado con un microscopio de medición y asegúrese de que tenga un grosor aproximado de 150 μm. Se puede almacenar indefinidamente a temperatura ambiente.
2. Fabricación de chips de cultivo de tejidos basados en microfluidos polidimetilsiloxano (PDMS)
- Fije la oblea depositada por SU-8 a un recipiente (por ejemplo, una placa de Petri de plástico de 15 cm) con cinta adhesiva de doble cara.
- Sople el polvo de la oblea con gas nitrógeno.
- Para silanizar, coloque la oblea depositada en SU-8 en una cámara de vacío junto con un recipiente pequeño (por ejemplo, un plato de 35 mm). Eche 10 μL de (tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahidrooctil)-1-triclorosilano en el recipiente pequeño. No aplique directamente el (tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahidrooctil)-1-triclorosilano a la oblea SU-8.
- Cierre herméticamente la cámara de vacío y encienda una bomba de vacío durante al menos 2 h.
- Tome un vaso de plástico y vierta el elastómero de silicona (por ejemplo, Silpot 184 o equivalente, Sylgard 184) y el agente de curado en una proporción de peso de 10:1. Luego, mezcle bien con una espátula y desgasifique en la cámara de vacío hasta que las burbujas se eliminen por completo.
- Vierta la mezcla de PDMS en el recipiente con la oblea SU-8 hasta el grosor deseado (3-4 mm) y desgasifique nuevamente para eliminar las burbujas.
- Hornee el PDMS en un horno a 60 °C durante al menos 3 horas para curar completamente el PDMS.
- Después de enfriar, corte el PDMS curado de la oblea con un bisturí o una hoja de afeitar.
- Para crear las dos cámaras del chip de cultivo de tejidos, perfore dos orificios donde se encuentran los dos compartimentos utilizando un punzón de biopsia de 1,5 mm de diámetro.
- Para crear un depósito mediano, prepare otra mezcla de PDMS (elastómero de silicona y el agente de curado en una proporción de peso de 10:1) y viértala en una nueva placa de Petri de 10 cm. Ajuste el volumen de vertido a 5 mm de espesor de PDMS.
- Hornee el PDMS en un horno a 60 °C durante al menos 3 horas para curar completamente el PDMS.
- Después de enfriar el PDMS, corte el PDMS curado con un bisturí para obtener un anillo rectangular.
- Une la capa inferior con el depósito medio aplicando PDMS sin curar entre ellas y horneando las capas de PDMS ensambladas. Esta estructura unida da como resultado el chip de cultivo de tejidos PDMS.
- Limpie el chip de cultivo de tejidos PDMS con cinta adhesiva para eliminar el polvo y las partículas pequeñas de la superficie. Los chips de cultivo de tejidos PDMS se pueden almacenar a temperatura ambiente si se protegen del polvo y los rayos UV.
3. Preparación de la cultura
- Cultivo medio
nota: Todos los medios que se enumeran a continuación deben filtrarse para su esterilización, a menos que se indique lo contrario. Los medios preparados pueden almacenarse a 4 °C y utilizarse en el plazo de un mes.
- Para preparar mTeSR Plus medium: combine un frasco de 100 mL de mTeSR Plus 5x supplement con un frasco de 400 mL de mTeSR Plus Basal Medium.
- Para preparar 100 mL de medio KSR: En 85 mL de Dulbecco's Modified Eagle Medium o DMEM/F12, agregue 15 mL de reemplazo de suero Knockout (KSR, 15%), 1 mL de suplemento comercial de glutamina (1%) y 1 mL de aminoácido no esencial (NEAA, 1%).
- Para preparar 100 mL de medio N2: En 100 mL de medio Neurobasal, agregue 1 mL de N2 (100x), 1 mL de suplemento comercial de glutamina y 1 mL de NEAA.
- Para preparar 250 mL de medio de maduración: En 250 mL de medio Neurobasal, agregue 5 mL de B27 (2%), 2.5 mL de suplemento comercial de glutamina (1%) y 2.5 mL de Penicilina/Estreptomicina (1%).
- Vuelva a suspender los compuestos (ácido retinoico (RA), SB431542, LDN-193189, SU5402, DAPT, SAG, Y-27632) en DMSO de grado de cultivo celular a la concentración deseada. Prepare las alícuotas y guárdelas a -20 °C durante un máximo de 6 meses. Se utilizan las siguientes soluciones madre: 1 mM RA, 10 mM SB431542, 100 μM LDN-193189, 10 mM SU5402, 10 mM DAPT, 1 mM SAG, 10 mM Y-27632.
- Revestimiento
nota: Para evitar la polimerización de la matriz de la membrana basal por calor, evite los ciclos repetitivos de congelación-descongelación. Si es posible, maneje todos los procedimientos de recubrimiento con puntas de pipeta y tubos preenfriados. La matriz de la membrana basal debe descongelarse durante la noche a 4 °C y alícuota utilizando puntas de pipeta y tubos preenfriados. Las alícuotas se pueden congelar a -20 °C o -80 °C.
- Descongele la alícuota congelada a 4 °C en hielo. La alícuota debe mantenerse fría durante el procedimiento de recubrimiento. Con una punta de pipeta preenfriada, diluya la matriz de la membrana basal con DMEM/F12 helado en una proporción de 1:40. La matriz de membrana basal diluida no utilizada puede almacenarse a 4 °C durante 2-3 días, siempre que no se haya producido polimerización.
- Agregue 1 mL de la solución de matriz de membrana basal/DMEM-F12 para cubrir un pocillo de la placa de 6 pocillos.
- Incubar la placa a temperatura ambiente durante al menos una hora, o 4 °C durante la noche. Las placas recubiertas pueden almacenarse a 4 °C durante un máximo de una semana.
>4. Mantenimiento de las células iPS
- Prepare platos recubiertos de matriz de membrana basal como se mencionó anteriormente en el paso 3.2.
- Aspire completamente el medio mTeSR Plus. Lave el pocillo una vez con PBS y agregue 0,5 mL de reactivo de paso (ver Tabla de Materiales). Espere unos segundos y aspire la solución.
- Incubar la placa a 37 °C en la incubadora durante 5 min o hasta que las células se vuelvan redondas.
nota: El tiempo de incubación puede variar entre las diferentes líneas celulares iPS y la confluencia. Verifique periódicamente bajo el microscopio para determinar el tiempo de disociación durante la incubación.
- Agregue 1 mL de medio mTeSR Plus y golpee la placa durante 30-60 s para separar las colonias.
- Mezcle suavemente 1 mL de la solución de suspensión celular con 7 mL de mTeSR fresco más medio. No pipetee más de 5 veces.
- Placa en una proporción de 1:8. Por lo general, agregue 1 mL de la suspensión del paso 5.5 y agregue 1 mL de mTeSR más medios complementados con 5-10 μM de Y-27632 (inhibidor de ROCK). La relación de dilución de paso depende de la línea iPSC.
- Coloque la célula en una incubadora de CO2/37 °C al 5%. Al día siguiente, retire Y-27632 añadiendo mTeSR Plus medio fresco. A partir de entonces, cambie el medio cada dos días inicialmente, y todos los días a medida que la célula alcance una mayor confluencia.
>5. Diferenciación de células iPS en neuronas motoras
- Paso: iPSC para la diferenciación de neuronas motoras
nota: La diferenciación se puede llevar a cabo con éxito en el protocolo 3D (5.2).
- Permitir que las células iPS indiferenciadas crezcan hasta que alcancen una confluencia de aproximadamente el 80% en el medio mTeSR Plus en una placa de 6 pocillos.
- Aspirar completamente el medio. Lave inmediatamente el pocillo una vez con PBS estéril y agregue 0,5 mL de solución de disociación celular a las células.
- Incubar la placa a 37 °C en la incubadora durante aproximadamente 2-3 min, o hasta que las células se separen y se redondeen pero permanezcan adheridas al pocillo.
- Añada 1 mL de medio y pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo unas cuantas veces con una pipeta serológica de 5 mL. Transfiera la suspensión celular a un tubo de 15 mL que consta de 4 mL del medio.
- Centrifugar a 200 x g durante 3 min.
- Aspirar cuidadosamente el sobrenadante, dejando el pellet intacto, y resuspender las células en 1 mL del medio suplementado con 10 μM de Y-27632.
- Cuente las células con un hemocitómetro y proceda a 5.2 (diferenciación 3D).
- Formación de esferoide de neurona motora (MNS) en diferenciación 3D ("protocolo 3D")
nota: Diariamente se realiza un cambio completo del medio desde los días 0 a 12 de diferenciación (Figura 2).
- Siembre las células iPS del paso 5.1.7 a una placa inferior U de 96 pocillos a 40.000 células/pocillo en 100 μL de mTeSR Plus suplementado con 10 μM de Y-27632.
- Al día siguiente, reemplace cada pocillo con 100 μL del medio fresco.
- En los días 0 y 1: Aspirar el medio de cultivo y sustituirlo por 100 μL de medio KSR (3.1.2) suplementado con 10 μM de SB431542 y 100 nM de LDN-193189.
- En los días 2 y 3: Aspirar el medio de cultivo y sustituirlo por 100 μL de medio KSR suplementado con 10 μM de SB431542, 100 nM de LDN-193189, 5 μM de DAPT, 5 μM de SU5402, 1 μM de RA y 1 μM de SAG.
- Los días 4 y 5: Preparar un medio mixto compuesto por un 75% de medio KSR y un 25% de medio N2 (3.1.3). A continuación, aspire el medio de cultivo y sustitúyalo por 100 μL de medio mixto suplementado con 10 μM de SB431542, 100 nM de LDN-193189, 5 μM de DAPT, 5 μM de SU5402, 1 μM de RA y 1 μM de SAG.
- Los días 6 y 7: Prepare un medio mixto compuesto por un 50% de medio KSR y un 50% de medio N2. A continuación, aspire el medio de cultivo y sustitúyalo por 100 μL de medio mixto suplementado con 5 μM de DAPT, 5 μM de SU5402, 1 μM de ácido retinoico y 1 μM de SAG.
- Los días 8 y 9: Prepare un medio mixto compuesto por un 25% de medio KSR y un 75% de medio N2. A continuación, aspire el medio de cultivo y sustitúyalo por 100 μL de medio mezclado suplementado con 5 μM de DAPT, 5 μM de SU5402, 1 μM de RA y 1 μM de SAG.
- En los días 10 y 11: Reemplace el medio con 100 μl de medio N2 suplementado con 5 μM de DAPT, 5 μM de SU5402, 1 μM de RA y 1 μM de SAG.
- El día 12: Proceda a transferir los MN al chip de cultivo de tejidos (Paso 6) o reemplace el medio con 100 μL del medio de maduración (3.1.4) suplementado con 20 ng/mL de factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF).
nota: El MNS se puede transferir al chip de cultivo de tejidos desde el día 12 hasta el día 19. Los esferoides que no se transfieren deben mantenerse cultivados en placas inferiores U de 96 pocillos en medio de maduración suplementados con 20 ng/mL de BDNF hasta la transferencia.
>6. Preparación del chip de cultivo de tejidos para la formación de organoides nerviosos motores (MNO)
- Esterilice el PDMS preparado (a partir del paso 2.13) sumergiéndolo en etanol al 70% en la placa de Petri durante al menos 1 h.
nota: Todos los pasos siguientes deben manipularse en una cabina de bioseguridad.
- Esterilizar el cristal del microscopio (76 x 52 mm) sumergiéndolo en etanol al 70% en la placa de Petri.
- Durante el proceso de secado del cristal del microscopio, coloque el dispositivo PDMS sobre el cristal del medio microscopio húmedo y déjelo secar por completo esperando toda la noche. Una vez que esté completamente seco, el dispositivo PDMS debe adherirse al vidrio.
nota: Esta unión no es permanente para permitir el desprendimiento de los dispositivos PDMS del cristal del microscopio después del cultivo para la recolección de tejidos. La unión permanente por plasma de oxígeno se puede utilizar para maximizar la adhesión entre el PDMS y el vidrio, pero prohibiría el desmontaje de los chips y la recolección de tejidos.
- Cubrir la superficie del microcanal con un dispositivo PDMS y un cristal de microscopio con 30 μL de matriz de membrana basal diluida en DMEM/F12 (1:40) haciendo una gota en un lado de la entrada del canal y luego aspirar la solución desde el otro lado de la entrada con una pipeta o bomba de succión (Figura 3A). No aspire demasiado volumen de solución para evitar la contaminación por burbujas.
- A continuación, incube el dispositivo PDMS durante 1 hora a temperatura ambiente o durante la noche a 4 °C en un recipiente secundario (por ejemplo, una placa de Petri).
>7. Formación de organoides nerviosos motores (MNO)
- Reemplace la solución de recubrimiento con 150 μL precalentados de medio de maduración suplementado con 20 ng/mL de BDNF justo antes de usar.
- A continuación, coloque el MNS del paso 5.2.9 en la entrada del microcanal con una micropipeta con punta de diámetro ancho. El MNS puede establecerse espontáneamente en la parte inferior del dispositivo por gravedad. No aplique demasiada presión al inyectar el MNS (Figura 3B).
nota: Si el MNS está atascado en la pared lateral de un orificio en un chip de cultivo de tejidos, aspire suavemente la solución desde el otro lado de la entrada.
- Llene un depósito pequeño (por ejemplo, un tapón de tubo de 15 ml) con agua estéril y colóquelo cerca del chip de cultivo de tejidos en el recipiente secundario para evitar la evaporación del medio. A continuación, colócalo en una incubadora de CO2/37 °C al 5%.
- Para un cambio de medio, aspire el medio de cultivo agotado desde el centro del depósito de medio (Figura 3C). No aspire todo el medio y el tejido.
- Agregue suavemente un medio de maduración fresco (con BDNF). El medio debe cambiarse cada 2-3 días. No seque el medio de cultivo en ningún momento durante el cultivo. Los axones crecen desde un MNS hacia el canal y se ensamblan espontáneamente en un solo haz en 2-3 semanas, lo que resulta en la formación de un MNO. MNO se puede cultivar durante más de 1 mes adicional en el dispositivo.
