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>1. Cultivos celulares y prediferenciación
- Cultivo y prediferenciación de células madre neurales
- Prepare cubreobjetos recubiertos de poli-D-lisina. Coloque un cubreobjetos estéril (20 mm de diámetro) en una placa de 12 pocillos. Cubra el cubreobjetos con poli-D-lisina, 0,1% p/v, en agua para una mejor adhesión celular en los cubreobjetos siguiendo los siguientes pasos.
NOTA: Se deben determinar las condiciones óptimas para cada línea celular y aplicación.
- Cubra asépticamente la superficie del cubreobjetos con poli-D-lisina, 0,1% p/v, en agua. Mece suavemente para asegurar una capa uniforme de la superficie del cubreobjetos.
- Después de cultivar durante la noche (~12 h) a 37 °C, retire la solución de poli-D-lisina y enjuague la superficie 3 veces con 1 ml de agua estéril.
- Seque las celdas al menos 30 minutos antes de sembrarlas.
- Cultivo y prediferenciación de células madre neurales murinas C17.2 (C17.2-NSC)
- Incubar C17.2-NSCs en un matraz de 25cm2 en el medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS), 5% de suero equino (HS) y 1% de penicilina/estreptomicina a 37 °C y 5% de CO2 durante ~2 - 3d.
- Cuando las células alcancen el 85% de confluencia, retire el medio, lave las células con 1 mL de PBS y agregue 1 mL de tripsina fresca (0,25%) en el matraz. Déjalo por 1 min; a continuación, añada 1 mL de medio de cultivo al matraz y pipetee hacia arriba y hacia abajo varias veces para asegurar una suspensión unicelular.
- Cuente la densidad de las células en la suspensión con un hemocitómetro. Calcule el volumen requerido de suspensión celular para obtener una concentración celular final de 2 x 104 celdas/mL.
- Siembre las C17.2-NSC en los cubreobjetos recubiertos en la placa de 12 pocillos con una densidad de ~2 x 104 celdas por pocillo. Compruebe la densidad celular bajo un microscopio.
NOTA: Para obtener un mejor resultado, se debe determinar la densidad celular óptima antes del experimento de inmunofluorescencia.
- Incubar las células a 37 °C en una incubadora de células durante 12 h para permitir la fijación.
- Después de la fijación, lavar las células 2 veces con 1 mL de PBS y cultivar las células con un medio de diferenciación que consista en DMEM/F12 con un suplemento de N2 al 1% durante 48 h antes del tratamiento con plasma.
- Cultivo y prediferenciación de células madre neurales primarias de rata
- Cultivo de la suspensión primaria de NSC (células madre neurales) de rata en medio de crecimiento de NSC de rata en matraces T25 sin recubrimiento a una densidad de 5 x 105 células.
- Comprobar la formación de neuroesferas bajo un microscopio invertido. Asegúrese de que la morfología de las neuroesferas exhiba complejos multicelulares esféricos y transparentes.
- Cuando las neuroesferas alcancen un diámetro de 3 mm o más, transfiera la suspensión de la neurosfera a un tubo de centrífuga estéril de 15 ml y deje que las neuroesferas se asienten por gravedad.
- Retire el sobrenadante con cuidado para dejar las neuroesferas en un volumen mínimo de medio.
- Enjuague las neuroesferas 1 vez con 5 mL de PBS y deje que las neuroesferas se asienten por gravedad. Retire el sobrenadante para dejar un volumen mínimo de PBS.
- Agregue un volumen adecuado de medio de diferenciación para ajustar la densidad celular a ~ 12 - 15 neuroesferas por mililitro. El medio de diferenciación para las NSC primarias de rata consiste en DMEM/F12, 2% B27 y 1% FBS.
- Siembre 1 mL de suspensión de neurosfera en cada cubreobjetos recubierto en la placa de 12 pocillos.
NOTA: Agite el plato suavemente para asegurarse de que las neuroesferas se distribuyan uniformemente. Este paso es fundamental para un mejor resultado de inmunofluorescencia.
- Coloque la placa en la incubadora y deje que se prediferencie durante 24 horas antes del tratamiento con plasma.
>2. Preparación de los chorros de plasma
- Elija un tubo de cuarzo semiabierto con un diámetro interno de 2 mm y un diámetro externo de 4 mm. Inserte un cable de alto voltaje con un diámetro de 2 mm en el tubo.
- Inserte el tubo de cuarzo con el cable de alto voltaje en una jeringa de 5 ml y use un soporte para montarlo dentro del centro de la jeringa. Establezca la distancia entre el extremo sellado del tubo de cuarzo y la punta de la jeringa en 1 cm.
- Conecte un tubo de caucho de silicona de 1 m (con un diámetro interior de 12 mm) al extremo abierto de la jeringa y, a continuación, conéctelo al caudalímetro y a la válvula de gas en secuencia.
>3. Adquisición de los Jets
- Conecte el circuito como se muestra en la Figura 1. Conecte el cable de salida de la fuente de alimentación al dispositivo de chorro de plasma y luego, conecte la punta de la sonda de alto voltaje con el cable de salida para detectar el voltaje. Conecte el otro extremo de la sonda de alto voltaje al osciloscopio para registrar la información del voltaje de salida. Revise todo el circuito y asegúrese de que la fuente de alimentación, el osciloscopio y la sonda de alto voltaje estén conectados a tierra.
- Revise la línea de gas. Asegúrese de que el tubo de gas se haya conectado al dispositivo de chorro de plasma; luego, abra la válvula de gas del helio (fracción de volumen, 99.999%) y oxígeno (fracción de volumen, 99.999%) y ajuste el flujo de gas a 1 L : 0.01 L/min (He:O2).
NOTA: Deje que el gas fluya durante varios minutos antes de encender la fuente de alimentación por primera vez.
- Establezca la amplitud de pulso, la frecuencia y el ancho de pulso en 8 kV, 8 kHz y 1600 ns, respectivamente. Vuelva a verificar el circuito y luego, encienda el botón de salida para crear un chorro de plasma.
PRECAUCIÓN: No toque el cable de alto voltaje en ningún momento.
>4. Tratamiento con plasma de células madre neurales
- Ajuste la distancia entre la boquilla de la jeringa y el orificio del pocillo de la celda a 15 mm.
NOTA: La distancia se mide desde la parte inferior de la plataforma donde se coloca la placa de 12 pocillos.
- Saque la placa de 12 pocillos de la incubadora y cambie el medio de las células prediferenciadas a 800 μL de medio de diferenciación fresco.
- Divida las células en tres grupos: un grupo de control no tratado, un grupo de tratamiento de flujo de gas He-and-O2 (1%) de 60 s y un grupo de tratamiento con plasma de 60 s.
NOTA: No hay pérdida obvia de líquido bajo la condición de tratamiento.
- Coloque la placa de 12 pocillos debajo de los chorros de plasma, asegúrese de que la boquilla de la jeringa esté fija en el centro de cada orificio y administre el tratamiento correspondiente a los diferentes grupos mencionados en el paso 4.3.
NOTA: Los controles no tratados se mantuvieron en medio de diferenciación a temperatura ambiente durante el procedimiento experimental para garantizar condiciones de tratamiento uniformes. El grupo de tratamiento de flujo de gas He-y-O2 (1%) fue tratado solo con un flujo de gas He y O2 (1%), sin generación de plasma. Todos los tratamientos deben realizarse por triplicado.
>5. Diferenciación de células madre neurales
- Después del tratamiento, retire el cultivo original y agregue 1 mL de nuevo medio de diferenciación a cada pocillo.
- Incubar las células en la incubadora a 37 °C y 5% de CO2 durante 6 d. Cambie el medio cada dos días.
- Comprobar diariamente el estado de diferenciación de los diferentes grupos bajo un microscopio óptico de contraste de fase invertido Figura 2. Seleccione al azar al menos 12 campos y tome fotos para registrar los cambios morfológicos.
