Generación de precursores de interneuronas corticales a partir de células madre embrionarias de ratón

Resumen

Fuente: Tischfield, D. J., et al Diferenciación de células madre embrionarias de ratón en precursores de interneuronas corticales. J. Vis. Exp. (2017)

Este video presenta un método para generar precursores de interneuronas corticales a partir de células madre embrionarias de ratón. El protocolo consiste en cultivar las células madre en medios que contienen inhibidores específicos de moléculas pequeñas, que facilitan la proliferación y la agregación de células madre en cuerpos embrioides (EB). Posteriormente, las EBs se disocian con enzimas y se colocan en pocillos de placa de cultivo recubiertos con proteínas de adhesión para promover su diferenciación en precursores de interneuronas corticales.

Protocolo

1. Preparación de medios

NOTA: Calentar todos los medios a 37 ° C antes de su uso en cultivo celular.

1. Medios de fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) (para preparar 500 mL)
   1. Agregue 50 mL de suero fetal bovino (FBS) a 449 mL de Medio de Águila Modificado (DMEM) de Dulbecco y filtre a través de una unidad de filtro de poros de 500 mL de 0,22 μm.
   2. Añadir 1 mL de agente antimicrobiano (50 mg/mL) después de la filtración. Almacene los medios a 4 °C durante un máximo de 1 mes o alícuotas y guárdelos a ≤ -20 °C.
2. Medios N2 (para preparar 500 mL)
   1. Añadir 5 mL de L-alanina-L-glutamina (100x) y 500 μL de 2-Mercaptoetanol (55 mM) a 489,5 mL DMEM: Mezcla de nutrientes F-12 (DMEM/F-12), y filtrar a través de una unidad de filtro de poros de 500 mL y 0,22 μm.
   2. Añadir 1 mL de agente antimicrobiano (50 mg/mL) y 5 mL de suplemento N2-B después de la filtración. Guarde los medios a 4 °C en la oscuridad durante un máximo de 1 mes.
3. Medio de crecimiento sin suero (KSR) (para preparar 500 mL)
   1. Agregue 75 mL de suplemento medio sin suero, 5 mL de L-glutamina (100x), 5 mL de aminoácidos no esenciales MEM (MEM-NEAA) (100x) y 500 μL de 2-Mercaptoetanol (55 mM) a 413,5 mL de DMEM que no contiene glutamina, y filtre a través de una unidad de filtro de poros de 500 mL de 0,22 μm.
   2. Añadir 1 mL de agente antimicrobiano (50 mg/mL) después de la filtración. Almacene el medio a 4 °C durante un máximo de 1 mes.
4. Medios de células madre embrionarias de ratón (para preparar 500 mL)
   1. Agregue 75 mL de FBS de grado de células madre, 5 mL DE MEM-NEAA (100x), 5 mL de L-glutamina (100x) y 500 μL de 2-Mercaptoetanol (55 mM) a 413,5 mL de DMEM que no contiene glutamina, y filtre a través de una unidad de filtro de poros de 500 mL de 0,22 μm.
   2. Añadir 1 mL de agente antimicrobiano (50 mg/mL) después de la filtración. Almacene los medios a 4 °C en la oscuridad durante un máximo de 1 mes o alícuotas y guárdelos a ≤ -20 °C.

>2. Cultivo de mESCs

1. Coloque las células alimentadoras de MEF mitóticamente inactivas en medios MEF en placas tratadas con cultivo de tejidos a 3-4 x 10⁴ células/^cm2. Espere al menos 12 horas para que se asienten en una incubadora de cultivo celular a 37 °C con ≥ 95% de humedad relativa y 5% de CO₂ antes de colocar las mESCs. Si no se utiliza inmediatamente, reemplace el medio MEF cada 3 días. Deseche los MEF si no se usan dentro de los 7 días posteriores al enchapado.
2. Agregue mESCs (rango de densidad de 1-4 x 10⁴ células/cm2) a las placas MEF en medios mESC que contengan el factor inhibidor de la leucemia en ratón (mLIF) (1,000 U/mL). Incubar las células a 37 °C con ≥ 95% de humedad relativa y 5% de CO₂.
3. Pase las mESC usando tripsina-EDTA (0.05% de tripsina) (1:5-1:10) una vez que el plato se vuelve ~ 70-80% confluente o si las colonias comienzan a tocarse. Esto suele ocurrir cada 2 días, pero puede tardar hasta 4 o 5 días, dependiendo de la densidad inicial del recubrimiento.
4. Mantenga las mESC en una capa alimentadora de MEF en un medio mESC para mantener la pluripotencia.
5. Antes de comenzar la diferenciación, pase las células al menos una vez a placas recubiertas de gelatina sin MEF para diluir los MEF.​
   1. Prepare las placas recubiertas de gelatina añadiendo gelatina al 0,1% en solución salina tamponada con fosfato (PBS) con Ca²⁺/Mg²⁺ a una placa tratada con cultivo de tejidos y déjela a 37 °C durante al menos 1 h. Placa de 1,5-2 x 10⁶ células/10 cm (2,7-3,6 x 10⁴ células/cm²) y deje que las células se expandan durante 2 días antes de comenzar la diferenciación.

>3. Diferenciación de mESCs hacia progenitores telencéfalos similares a MGE

1. Día de diferenciación (DD) 0 = "células flotantes"
   1. Después de que las mESC hayan crecido en placas recubiertas de gelatina durante 2 días, aspire el medio y lave las células una vez con PBS sin Ca²⁺/Mg²⁺. Agregue suficiente tripsina-EDTA (0,05% de tripsina) para cubrir la superficie de la placa (normalmente 4 mL de tripsina-EDTA para una placa de cultivo de tejidos de 10 cm) y vuelva a colocar las células en la incubadora a 37 °C con ≥95% de humedad relativa y 5% de CO₂ durante 4 min.
   2. Después de 4 minutos, apague la tripsina-EDTA usando 2 veces el volumen con medios mESC. Transfiera las celdas a un tubo de centrífuga de tamaño adecuado y centrifugue las celdas a 200 x g durante 5 min. Después de 5 minutos, retire el tubo y aspire el medio sin alterar el pellet. Vuelva a suspender el pellet en un medio KSR:N2 de 1 mL (1:1) que contenga el inhibidor de BMP LDN-193189 (250 nM) y el inhibidor de Wnt XAV-939 (10 μM).
   3. Mida la concentración de células con un hemocitómetro o un contador de células automatizado. Comience a cultivar células como cuerpos embrioides (EB) añadiendo 75.000 células/mL en medios KSR:N2 (1:1) que contengan LDN-193189 (250 nM) y XAV-939 (10 μM) en placas de cultivo de tejidos no adherentes. Incubar las células a 37 °C con ≥ 95% de humedad relativa y 5% de CO₂.
2. En DD1, prepárese para el "aterrizaje" celular recubriendo placas tratadas con poli-L-lisina (10 μg/mL en PBS con Ca²⁺/Mg²⁺) durante la noche (O/N) a 37 °C con ≥ 95% de humedad relativa o durante al menos 1 h.
3. En DD2, aspirar la poli-L-lisina y recubrir las placas con laminina (10 μg/mL en PBS con Ca²⁺/Mg²⁺) O/N a 37 °C con ≥ 95% de humedad relativa.
   nota: Si bien O/N es óptimo, tan solo 2 h pueden ser suficientes. Si las placas no se utilizan al día siguiente, aspire laminina, reemplácela con PBS sin Ca²⁺/Mg²⁺ y almacene a 4 °C durante un máximo de 2 semanas.
4. DD3 ("células terrestres")
   1. Antes de comenzar la disociación EB, aspire la laminina y deje que las placas se sequen completamente en una campana de cultivo de tejidos. No utilice placas que parezcan brillantes o visiblemente mojadas. Transfiera los EB con el medio a un tubo de 15 mL y centrifugue durante 3-4 minutos a 15 x g o hasta que los EB se hayan granulado.
5. Aspire el medio y agregue 3 mL de solución de desprendimiento de células que contenga DNasa (2 U/mL) e incube a 37 °C con ≥ 95% de humedad relativa y 5% de CO₂ durante 15 min. Agite suavemente el tubo cada 3 min para ayudar en la disociación de EB.
6. Una vez que los EB ya no sean visibles o hayan transcurrido 15 min, añadir 6 mL KSR:N2 (1:1) que contengan DNasa (1 U/mL) y centrifugar durante 5 min a 200 x g.
7. Coloque las células en KSR:N2 (1:1) que contienen LDN-193189 (250 nM), XAV-939 (10 μM) y el inhibidor de ROCK Y-27632 (10 μM) a 4,5-5 x 10⁴ células/cm².

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Fibroblastos embrionarios de ratón (CF-1 MEF IRR 7M)	MTI-Globalstem	GSC-6101G	1 vial de MEFs 7M es suficiente para cuatro placas TC de 10 cm.
FBS	Biológicos de Atlanta	S11150H
Primocina	Invivogen	Hormiga-pm-2	También se conoce como agente antimicrobiano. No filtre con medios base, agregue después de la filtración.
Suplemento de N2-B	Tecnologías de células madre	7156	No filtre con medios base, agregue después de la filtración
Glutamax (100x)	ThermoFisher	35050061	También se conoce como L-alanina-L-glutamina.
Reemplazo de suero KnockOut (KSR)	ThermoFisher	10828028	También conocido como suplemento medio sin suero.
L-glutamina (100x)	ThermoFisher	25030081
MEM-NEAA (100x)	ThermoFisher	11140050
2-Mercaptoetanol	ThermoFisher	21985023
DMEM de eliminación	ThermoFisher	10829018
Hyclone FBS	VWR	82013-578	También se conoce como FBS de grado de células madre.
Plato tratado con cultivo de tejidos (10cm)	Halcón BD	353003
Placa de Petri estéril no adherente (10 cm)	VWR	25384-342
Factor inhibidor de la leucemia (mLIF)	Quimio	ESG1107	No congelar, almacenar a 4'C.
DMEM/F12	ThermoFisher	11330032
Solución de gelatina al 0,1%	ATCC	ATCC PCS-999-027
Laminina	sigma	L2020
Poli-L-lisina	sigma	P6282
Tripsina-EDTA (0,05%)	ThermoFisher	25300054
Accutase	ThermoFisher	A1110501	También conocido como reactivo de disociación celular que contiene no tripsina.
RQ1 DNasa libre de ARNasa	Promega	M610A
LDN-193189	Derivante	04-1974	Vuelva a suspender en DMSO y almacene a -80 ° C en alícuotas de un solo uso
XAV939	Derivante	04-1946	Vuelva a suspender en DMSO y almacene a -80 ° C en alícuotas de un solo uso
Inhibidor de ROCK (Y-27632)	Tocris	Año 1254	Vuelva a suspender en DMSO y almacene a -80 ° C en alícuotas de un solo uso