Generación de progenitores neurales a partir de células madre embrionarias de ratón mediante el método de la gota colgante

Resumen

Fuente: Hanafiah, A., et al. Diferenciación y caracterización de progenitores neurales y neuronas a partir de células madre embrionarias de ratón. J. Vis. Exp. (2020).

El video demuestra la diferenciación de células madre embrionarias de ratón (mESCs) a cuerpos embrioides (EBs) por el método de gota colgante. Al suspender las mESC en gotas colgantes e incubarlas, las células se agregan para formar EB, que se diferencian aún más en células progenitoras neuronales (NPC) utilizando un medio de diferenciación suplementado con ácido retinoico (AR).

Protocolo

1. Cultura mESC

1. Cubra una placa tratada con cultivo de tejidos de 10 cm con gelatina al 0,1% y deje que la gelatina se asiente durante al menos 15-30 minutos antes de aspirarla.
2. Siembra fibroblastos embrionarios (MEF) de ratón irradiados con γ un día antes de cultivar las mESC en el medio mESC precalentado (medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) con 15% de suero fetal bovino (FBS), aminoácidos no esenciales, β-mercaptoetanol, L-glutamina, penicilina/estreptomicina, piruvato de sodio, factor inhibidor de la leucemia (LIF), PD0325901 (PD) y CHIR99021 (CH)).
3. Permita que los MEF irradiados con γ se asienten y se adhieran a la superficie de la placa antes de cultivar las células E14.
4. Descongele las ESC E14 en un baño de agua a 37 °C y transfiera rápidamente las células en un tubo cónico de 15 cm con medio mESC caliente. Granular las células a 200 x g durante 3 min y eliminar el sobrenadante.
5. Vuelva a suspender las células en 10 mL de medio mESC y coloque las células en la placa de cultivo que contiene los MEFs irradiados con γ sembrados anteriormente. Incubar el cultivo celular en una incubadora a 37 °C con un 5% de_CO2.
6. Para el paso del cultivo, aspire el medio y lave la placa con solución salina tamponada con fosfato (PBS) estéril 1x. Añadir suficiente tripsina al 0,05% para cubrir la superficie de la placa e incubar a 37 °C durante 3 min.
7. Neutralice la tripsina con medio mESC y pipetea para generar una suspensión unicelular. Centrifugar las células a 200 x g durante 3 min y eliminar el sobrenadante.
8. Cuente las células con un hemocitómetro o contador de células y siembre aproximadamente 5.0 x 10⁵ células en una placa de cultivo de 10 cm.
9. Vuelva a suspender las células en 10 mL de medio mESC, coloque las células en la placa de cultivo de tejidos recubierta de gelatina e incube los cultivos como se describió anteriormente><. nota: Se recomienda que las mESCs se pasen cada 2 días para evitar que las células se diferencien en sus colonias. El rojo fenol en el medio funciona únicamente como un indicador de pH y, dependiendo de la densidad celular, puede volverse amarillento (más ácido), antes de 2 días. Por lo tanto, puede ser necesario cambiar el medio todos los días. Los MEFs irradiados en γ eventualmente morirán después de un par de pasadas.

>2. EB, NPC y diferenciación de neuronas

1. Realice el protocolo de paso de cultivo y cuente las células.
2. Método de caída colgante (día 0)
   1. Para una placa de cultivo celular de 10 cm, cuente aproximadamente 2,5 x 10⁴ celdas donde 5,0 x 10² células estarán suspendidas en un medio de diferenciación de 20 μL (DMEM con 15% de FBS, aminoácidos no esenciales, β-mercaptoetanol, L-glutamina, penicilina/estreptomicina y piruvato de sodio). Aproximadamente cincuenta gotas de 20 μL que contienen las células se pueden colocar en una placa de 10 cm.
   2. Alícuota el número apropiado de células y, a continuación, centrifugar las células a 200 x g durante 3 minutos y eliminar el sobrenadante.
   3. Vuelva a suspender las células en el volumen adecuado de medio de diferenciación para una densidad celular de 5,0 x 10² células por 20 μL (por ejemplo, 2,5 x 10⁴ células en 1 mL de medio de diferenciación).
   4. Con una micropipeta o una pipeta repetidora, coloque gotas de 20 μL de la suspensión celular en la tapa de la placa de cultivo de tejidos. Asegúrese de que las gotas no estén demasiado cerca unas de otras para evitar que se fusionen.
      nota: Las gotas se pueden colocar en una placa de fijación tratada con cultivo de tejidos o en una placa de suspensión, ya que se colocarán en la tapa y no en la placa en sí. Para un enfoque más factible y estéril, coloque las gotas en una placa de cultivo de tejidos adjunta y transfiéralas a una placa de suspensión como se describe a continuación.
   5. Llene el plato con 5-10 ml de 1x PBS y vuelva a colocar la tapa con cuidado en el plato. Incubar el cultivo en la incubadora a 37 °C.
      nota: Se añade PBS a la placa de cultivo para evitar que las gotas se sequen.
3. El día 2, utilice una micropipeta para recoger las gotas de la tapa y colóquelas en una placa de suspensión de cultivo celular de 10 cm llena de 10 ml de medio de diferenciación. Incubar el cultivo en un agitador orbital agitando a baja velocidad en la incubadora.
4. El día 4, para cosechar los EB, recoja las células, centrifugue a 200 x g durante 3 min y retire el sobrenadante.
   nota: Los EB también se pueden lavar con 1x PBS según los requisitos de experimentos posteriores.
5. Para continuar el procedimiento e inducir la diferenciación de EB en células progenitoras neurales (NPC), prepare el medio de diferenciación con 5 μM de ácido retinoico (AR).
6. Retire el medio viejo granulando los EB a 100 x g durante 3 minutos o deje que los EB se asienten antes de aspirar el medio viejo. Añada 10 mL del medio de diferenciación que contenga 5 μM de RA a la placa de cultivo.
7. En el día 6, reemplace al menos la mitad del medio con medio fresco que contenga 5 μM de RA inclinando la placa y pipeteando el medio como se describe anteriormente><. nota: Se recomienda que al menos la mitad del medio se reemplace con medio fresco que contenga AR en los días 5 y 7. Tome nota del indicador de rojo fenol; Si se vuelve amarillento, es mejor reemplazar todo el medio.
8. El día 8, cosecha los NPC recolectando las células, centrifugando a 200 x g durante 3 minutos y eliminando el sobrenadante.
   nota: Los NPC también se pueden lavar con 1x PBS de acuerdo con las necesidades de experimentos posteriores. Si es necesario, los NPC se pueden congelar y descongelar nuevamente para su posterior cultivo y análisis. Si los NPC van a ser cultivados, la accutasa también se puede utilizar como alternativa a la tripsina.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
0.05% Tripsina + 0.53mM EDTA 1X	Corning	25-052-CV
0.1% Gelatina	sigma	G1890-100G	Preparado en agua desionizada
CHIR99021	Productos químicos de las Islas Caimán	13122
DMEM	Corning	10-017-CM
DMEM/F12 medio	Thermo Fisher Scientific	11320033
Búfer EB	Qiagen	Año 19086
etanol	111000200	Farmacia	Diluido en agua desionizada
Suero fetal bovino	Biológicos de Atlanta	S10250
L-glutamina	Thermo Fisher Scientific	25030024
Lif	N/A	N/A	Recogido del sobrenadante MEF
MEM Aminoácidos no esenciales	Corning	25-025-CL
PD0325901	Productos químicos de las Islas Caimán	Año 13034
Penicilina/estreptomicina	Corning	30-002-CL
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)	N/A	N/A	Preparado en agua desionizada
Cloruro de potasio	P217-500G	VWR
Fosfato de potasio monobásico anhidro	0781-500G	VWR
cloruro de sodio	BP358-10	Biorreactivos de Fisher
Fosfato de sodio, dibásico, heptahidratado	SX0715-1	Milipore
Ácido retinoico	sigma	R2625	Preparado en DMSO
Piruvato de sodio	Corning	25-000-CL
β-mercaptoetanol	Biorreactivos de Fisher	BP176-100