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1. Inducción de células madre neurales
NOTA: Dependiendo de las condiciones de la célula, aproximadamente 5 o 7 días después de la transfección, las células adherentes monocapa alcanzarán un 30 - 50% de confluencia (Figura 1C).
- Retire los sobrenadantes que contienen células flotantes y esferas y luego agregue 1 ml de medio progenitor neural (Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mix F-12 (DMEM/F12), que contiene 1x suplemento de N2, 0,1% (p/v) de albúmina sérica bovina (BSA), 1% (v/v) de antibióticos, 20 ng/ml de factor de crecimiento básico de fibroblastos (bFGF) y 20 ng/ml de factor de crecimiento epidérmico (EGF)) en las células adherentes.
- Opcionalmente, disocie las esferas celulares pipeteando suavemente y centrifugando las células a 170 x g durante 10 min. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender las células en 1 ml de medio progenitor neural en una nueva placa de 24 pocillos recubierta con matrigel según las instrucciones como respaldo.
- Cambie el medio cada dos días hasta que las células alcancen un 60 - 80% de confluente, generalmente después de 1 semana.
- Deseche el sobrenadante y agregue 1 ml de medio de células madre neurales (medio sin suero, NSC SFM). Disocie las células con un raspador de células, seguido de un pipeteo muy suave.
- Retire las células y siembre todas ellas en un pocillo de una placa de 6 pocillos. Agregue otro 1 ml de medio de células madre neurales para hacer 2 ml de medio para cada pocillo. Incubar las células a 37 °C en una incubadora con 5% de CO2.
- Cambia el medio cada dos días.
- Cuando las células alcancen el 60% de confluencia, disocie y vuelva a colocar las células en una proporción de 1:3 siguiendo los pasos de 1.4 y 1.6.
