Silenciamiento génico mediado por siRNA en células madre neurales

Resumen

Fuente: Nguyen, B. H., et al. Cultivo y manipulación de células de cresta neural O9-1. J. Vis. Exp (2018)

Este video demuestra el uso de ARN interferente pequeño (siRNA) para silenciar genes específicos de interés en células madre neurales y diferenciarlas en los tipos de células deseados utilizando el medio de diferenciación adecuado. Este procedimiento permite estudiar el papel crítico de genes específicos en el proceso de diferenciación de las células madre neurales.

Protocolo

1. Manipulación de células O9-1

1. Realización de la eliminación de siRNA en células O9-1
   1. Descongele y cubra una placa de 24 pocillos con una matriz de membrana basal antes de comenzar el experimento. Recupera y siembra células O9-1, lo que les permite crecer hasta un 60% a 80% de confluencia.
   2. Diluir los liposomas en medios libres de suero de acuerdo con el volumen de pocillo adecuado. Diluir el siRNA en medios sin suero hasta el final. Agregue siRNA diluido a los liposomas diluidos en una proporción recomendada por el fabricante. Mezclar bien pipeteando y luego incubar.
      nota: Siga la guía del fabricante sobre el volumen utilizado, el tiempo y la temperatura de incubación.
   3. Agregue un volumen apropiado de complejo lipídico siRNA a las células de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.
   4. Incubar las células durante 24 h en una incubadora de cultivo celular estándar (37 °C, 5% CO₂). Realice los pasos posteriores según corresponda (extraer ARN, extraer proteínas, tinción, etc.)
      NOTA: Los tiempos y concentraciones de knockdown del siRNA pueden variar según el experimento individual.

2. Diferenciación de células O9-1

1. Diferenciación de células O9-1 en osteoblastos
   1. Para preparar medios de diferenciación osteogénica, diluya lo siguiente en alfa-MEM (se indican las concentraciones finales): 0,1 μM de dexametasona, 100 ng/mL de proteína morfogenética ósea 2 (BMP2), 50 μg/mL de ácido ascórbico, 10 mM de b-glicerofosfato, 10% de FBS, 100 U/mL de penicilina y 100 μg/mL de estreptomicina.
   2. Detectar el marcador osteoblástico, osteocalcina, en osteoblastos diferenciados por inmunotinción, como se muestra en la Figura 1.
      NOTA: La diferenciación osteogénica también se puede evaluar mediante el uso de otros marcadores de osteoblastos o con tinción con rojo de alizarina o tinción con fosfatasa alcalina.
2. Diferenciación de células O9-1 en células musculares lisas
   1. Para preparar medios de diferenciación de células musculares lisas, diluya lo siguiente en DMEM (se indican las concentraciones finales): 100 U/mL de penicilina, 100 μg/mL de estreptomicina y 10% de FBS.
   2. Evalúa la diferenciación de las células del músculo liso con tinción de inmunofluorescencia mediante el uso de anticuerpos contra marcadores de las células del músculo liso, como la actina del músculo liso (SMA), que se muestra como ejemplo en la Figura 2.

Resultados

Figura 1: Tinción por inmunofluorescencia del marcador osteoblástico osteocalcina (Ocn) que indica que las células O9-1 dieron lugar a células osteoblásticas en condiciones de diferenciación osteogénica. Las células se tiñeron con el anticuerpo Ocn marcador osteoblástico (verde) y los núcleos se tiñeron con DAPI (azul). Las flechas indican células Ocn positivas. Osteocalcina (Ocn, un...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Línea celular de cresta neural craneal de ratón O9-1	Millipore Sigma	SCC049
DMEM, alto contenido de glucosa, sin glutamina	Gibco	11960-044
DMEM, glucosa alta	Hyclone	SH30243.01
FBS (suero fetal bovino)	Millipore Sigma	ES-009-B
Penicilina - estreptomicina	Gibco	Números 15140-122
L-glutamina 200mM (100X)	Gibco	25030-081
Tripsina-EDTA 0,25% en HBSS	Genesee Científico	25-510
DPBS (solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco) sin calcio ni magnesio	Lonza	17-512F
MEM aminoácidos no esenciales (MEM NEAA) 100X	Gibco	11140-050
Piruvato de sodio (100 mM)	Gibco	11360-070
2-Mercaptoetanol	sigma	M-7522
Factor de crecimiento de fibroblastos humanos recombinante-básico (rhFGF-básico)	Sistemas de investigación y desarrollo	233-FB-025
Mitomicina C	Roche	10107409001
Matriz Matrigel	Corning	356234
DMSO (dimetilsulfóxido)	Millipore Sigma	MX1458-6
Lipofectamina RNAiMAX	Thermo Fisher Scientific	13778-075
Opti-MEM I (1X)	Gibco	31985-070
Medio esencial mínimo, alfa 1X con sales de Earle, ribonucleósidos, desoxirribonucleósidos y L-glutamina	Corning	10-022-CV
ON-TARGETplus Wwtr1 siRNA	Dharmacon	L-041057
ON-TARGETplus Grupo no segmentado	Dharmacon	D-001810
ON-TARGETplus Yap1 siRNA	Dharmacon	L-046247
FCS (suero fetal de ternero)
ITS (insulina-transferrina-selenio)
TGF-b3
ácido ascórbico
BMP2 (proteína morfogenética ósea 2)
dexametasona
Suplemento B-27