Todos los procedimientos relacionados con la recolección de muestras se han realizado de acuerdo con las directrices del IRB del instituto.
>1. Aislamiento de colonias putativas de células progenitoras neurales inducidas (iNPC)
- Un día antes de recoger las colonias de iNPC, cubra una placa de 48 pocillos con laminina: diluya la laminina a 1 μg/ml en la solución salina tamponada con fosfato (DPBS) de Dulbecco, agregue 300 μl de la solución en las placas y manténgala a 4 °C durante 24 horas. Un día después, aspire la laminina de las placas y añada 200 μl de medios de neuroinducción (1:1 DMEM/F-12:Neurobasal, 1x N2, 1x B27, 1% GlutaMAX, 10 ng/ml de factor inhibidor de la leucemia humana, 3 μM CHIR99021, 2 μM SB431542) a los pocillos.
- Lavar las 6 placas de pocillos que contienen las colonias a recoger una vez con DPBS y añadir 2 ml de medios de neuroinducción por pocillo de 6 placas de pocillos. Elija las colonias mecánicamente: raspe alrededor de las colonias con una aguja delgada para deshacerse de las células circundantes; Ajuste el pipetman de 200 μl a 50 μl y recoja las colonias con las puntas de pipeta respectivas.
- Transfiera una colonia a cada uno de los pocillos de una placa de 48 pocillos recubierta de laminina y genere mecánicamente una suspensión de una sola celda pipeteando hacia arriba y hacia abajo 10 veces. Añadir el inhibidor de ROCK Y27632 en una concentración final de 10 μM a las células.
- Cultive las células en la placa de 48 pocillos a 37 °C, 5% de CO2 durante 2 días. Cambie el medio cada dos días hasta que las células alcancen el 80 - 90% de confluencia (aprox. 3 - 4 días).
