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1. Placas de 24 pocillos Preparación para cultivos de neuronas de alta densidad
NOTA: Realice los siguientes pasos (2-3) el día antes de la cosecha planificada de embriones.
- Introduzca dos placas de 24 pocillos en la campana de cultivo celular y abra el envase individual.
- Conecte una aguja de jeringa de 18 G a una jeringa de plástico de un solo uso de 1 ml.
- Sostenga la jeringa y apunte la punta de la aguja a ~ 1 mm a la izquierda hacia el centro del fondo del pocillo. Aplique una fuerza moderada (~250 g) para grabar el fondo del pozo (~1 mm de largo). Se formará una ranura y los materiales plásticos desplazados formarán un soporte elevado por encima de la superficie del pozo de fondo plano. Grabe otra ranura paralela de ~ 1 mm de largo a ~ 1 mm a la derecha del centro de la parte inferior de manera similar.
- Repita este paso para todos los pocillos de las dos placas de 24 pocillos. Las dos placas de 24 pocillos utilizadas para el cultivo de alta densidad ya están listas para el recubrimiento con poli-D-lisina (consulte el paso 2.8 a continuación).
>2. Cubreobjetos Preparación para cultivos de neuronas de baja densidad
- Utilice vidrio redondo #1 de 12 mm de diámetro.
- Coloque 50 cubreobjetos dentro de una placa de Petri de plástico estéril de 100 mm de diámetro y sumerja los cubreobjetos en 20 ml de solución de etanol al 70%. Coloque esta placa de Petri en una plataforma giratoria con una rotación de velocidad moderada (70 rpm) durante una hora. Retire el etanol al 70% y luego reemplácelo con un lote nuevo de etanol al 70%. Gire y lave durante una hora más.
- Deseche la solución de limpieza de etanol al 70%. Agregue agua estéril (filtrada a través de una unidad de filtro de 0,2 μm). Enjuague rigurosamente los cubreobjetos girando la placa de Petri a mano. Enjuague tres veces, cada vez reemplazándolo con agua estéril fresca.
- Coloque la placa de Petri con cubreobjetos dentro de una campana de cultivo celular estéril con flujo laminar. Aspire el agua de enjuague a través de la línea de vacío y agregue 10 ml de agua estéril filtrada para sumergir los cubreobjetos. Los cubreobjetos deben ser estériles y la superficie debe estar lo suficientemente limpia para el recubrimiento de poli-D-lisina.
- Abra dos placas de 24 pocillos de su empaque individual y colóquelas en el capó.
- Encienda la línea de vacío en el capó. Conecte una punta de pipeta de 200 μl a la línea de vacío y utilice una tijera para cortar la punta y crear una abertura más grande.
- Use unas pinzas de punta fina # 5 para recoger los cubreobjetos de la placa de Petri, uno a la vez, y use la línea de vacío para secar completamente el cubreobjetos. A continuación, coloque un cubreobjetos en cada uno de los pocillos de la placa de 24 pocillos. Los 50 cubreobjetos limpios deberían ser suficientes para llenar cada uno de los pocillos de las dos placas de 24 pocillos.
- Diluir la solución madre de poli-D-lisina (1 mg/ml) en una solución de trabajo (0,1 mg/ml) con un tampón de borato (pH 8,5). Para las cuatro placas de 24 pocillos (incluidas dos placas de alta densidad con fondo grabado), prepare 30 ml de solución de trabajo total.
- Añada 300 μl de solución de trabajo de poli-D-lisina al 0,1 mg/ml a cada pocillo con cubreobjetos de vidrio. Asegúrese de que los cubreobjetos estén completamente sumergidos en la solución. De lo contrario, use la punta de la pinza # 5 para presionar los cubreobjetos contra el fondo del pozo, y use la punta para guiar la solución de poli-D-lisina para cubrir toda la superficie de los cubreobjetos. Inspeccione visualmente todos los cubreobjetos para asegurarse de que no haya aire atrapado entre la placa y los cubreobjetos.
- Añadir 300 μl de solución de trabajo de poli-D-lisina al 0,1 mg/ml a cada pocillo de la placa de cultivo de alta densidad con fondo grabado. Gire con la mano para esparcir la solución y cubrir todo el fondo del pozo.
- Regrese las cuatro placas con poli-D-lisina a la incubadora de cultivo e incube O/N.
>3. Lavado y preacondicionamiento de placas para cultivo
NOTA: Los siguientes pasos (3-5) se llevan a cabo el día de la recolección de tejidos.
- Después de la incubación/recubrimiento de los cubreobjetos y las placas O/N de 24 pocillos, coloque las cuatro placas (dos con cubreobjetos de donante, dos placas aceptoras de alta densidad con fondo de plástico grabado) en la campana de cultivo. Utilice la línea de vacío para eliminar la solución de poli-D-lisina.
- Inmediatamente después de la extracción de la solución de poli-D-lisina, agregue ~ 1 ml de agua estéril a cada pocillo usando una pipeta de transferencia de plástico. Después de que todos los pozos estén llenos de agua, déjelos reposar durante 10 minutos. Retire el agua al vacío, luego agregue 300 μl de medio de lavado en cada pocillo para cubrir el fondo del pozo (con o sin cubreobjetos de vidrio). No permita que el recubrimiento de poli-D-lisina se seque.
- Regrese las cuatro placas a la incubadora de celdas. Las placas están listas para usar una vez que se preparan las neuronas dispersas del hipocampo.
>4. Recubrimiento de neuronas y cocultivo a largo plazo
- Lleve las dos placas de 24 pocillos con fondos grabados para neuronas de alta densidad a la campana de cultivo celular. Retire el medio de precondición de 300 μl al vacío. Placa de 0,6 ml de suspensiones celulares de alta densidad a 250.000 neuronas/ml.
- Introduzca las otras dos placas de 24 pocillos con cubreobjetos en la campana de cultivo y retire el medio de precondición de 300 μl por vacío. Placa de suspensiones celulares de baja densidad de 0,6 ml a 10.000 neuronas/ml en los cubreobjetos dentro de las dos placas de 24 pocillos.
- Regrese las cuatro placas de 24 pocillos a la incubadora. Deje reposar durante 2 horas.
- Voltee los cubreobjetos de baja densidad con neuronas adheridas al cultivo de alta densidad. Asegúrese de que las neuronas estén una frente a la otra (es decir, no separadas por el cubreobjetos de vidrio). A continuación, devuelva las dos placas con cocultivo a la incubadora.
>5.
- Cocultivos de alimento mediante la adición de 300 μl de medio de alimentación fresco (ver Materiales) durante el día in vitro (DIV) 5. No es necesario eliminar el 50% del medio de cultivo completo original, como informan muchos otros estudios. El medio de alimentación también contiene 15 μM de arabinósido de citosina (Ara-C, para producir una concentración final de 5 μM) para minimizar la posibilidad de contaminación y proliferación de la glía.
- Después de esta alimentación inicial, agregue 300 μl de medio de alimentación fresco sin Ara-C al pocillo cada semana. En caso de que el cultivo se mantenga durante más de un mes, reemplace la mitad del medio con medio de alimentación fresco cada semana después de un punto de tiempo de un mes (con el primer medio de reemplazo a medias en DIV33). Morfológicamente, tanto las neuronas de alta densidad como las de baja densidad parecen sanas hasta tres meses (el tiempo más largo observado por los experimentadores).