Diferenciación de células progenitoras neurales inducidas en astrocitos

Resumen

Fuente: Meyer, S., et al., Edenhofer, F. Derivación de fibroblastos humanos adultos y su conversión directa en células progenitoras neurales expandibles. J. Vis. Exp. (2015)

Este video demuestra el proceso para diferenciar células progenitoras neurales inducidas (iNPCs) en neuronas y astrocitos utilizando medios especializados.

Protocolo

1. Diferenciación de iNPCs

1. Diferenciación hacia el linaje neuronal
   1. Cultive células en placas recubiertas de laminina como se ha descrito anteriormente. Cambie el medio a neuro-diff-media (DMEM/F-12, 1x N2, 1x B27, 300 ng/ml de AMPc, 200 μM de vitamina C, 10 ng/ml de BDNF, 10 ng/ml de GDNF) cuando las células tengan aproximadamente un 70% de confluente. Cambie los medios cada dos días durante tres semanas. No divida las células durante la diferenciación.
   2. Después de tres semanas, las células deben expresar el marcador neuronal TUJ1. Para obtener neuronas más maduras y subtipos neuronales, continúe la diferenciación hasta 3 meses.
2. Diferenciación hacia el linaje glial
   1. Cambie el medio a medio de inducción glial (1:1 DMEM/F-12 : Neurobasal, 1x N2, 1x B27, 10 μM de β-mercaptoetanol, 100 μM de aminoácidos no esenciales, 1,5 mM de L-glutamina, 5 μg/ml de insulina, 40 ng/ml de T3) incluyendo 20 ng/ml de EGF para inducir la diferenciación en células precursoras gliales. Retire la mitad del medio y reemplácelo con medio nuevo cada dos días durante aproximadamente 2 semanas. Durante este período, las células deben dividirse 1:3 en presencia de 10 μM de inhibidor de ROCK Y27632 cuando se alcanza el 100% de confluencia.
   2. Después de 2 semanas, diferencie las células más en astrocitos: cuando las células estén casi confluentes, cambie el medio a un medio de astrocitos disponible comercialmente, cambie el medio cada dos días. Después de aproximadamente 7 días, las células comienzan a expresar marcadores de astrocitos (por ejemplo, GFAP). Si las células confluyen al 100% durante el protocolo de diferenciación, divídalas en una proporción de 1:2 en presencia de 10 μM de inhibidor de ROCK Y27632.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Medios de astrocitos	ScienCell	Año 1801
B27	Tecnologías de la Vida	17504-044
BDNF	Peprotech	450-02
campamento	sigma	A6885
DMEM	Tecnologías de la Vida	41966-029
DMEM F12	Tecnologías de la Vida	11320-033
Dmso	Roth	4720
DPBS	Tecnologías de la Vida	14190-094
FEAG	Tecnologías de la Vida	PHG0313
Fcs	Biochrom AG	50115
GDNF (en	Peprotech	450-10
insulina	Seralab	GEM-700-112-P
L-Glutamina	Tecnologías de la Vida	25030-024
Laminina	sigma	L2020
N2	Tecnologías de la Vida	17502-048
Neurobasal	Tecnologías de la Vida	21103-049
Aminoácidos no esenciales	Tecnologías de la Vida	11140-050
vitamina C	sigma	A4544
β-Mercaptoetanol	Tecnologías de la Vida	21985023