Diferenciación de una línea celular de neuroblastoma humano en neuronas maduras

Resumen

Fuente: Shipley, M. M., et al. Diferenciación de la línea celular de neuroblastoma humano SH-SY5Y. J. Vis. Exp. (2016).

Este video muestra una técnica para transformar células de neuroblastoma SH-SY5Y indiferenciadas en neuronas maduras completamente diferenciadas utilizando una técnica de paso sistemático. Esto implica cultivar las células en una serie de medios con niveles séricos gradualmente decrecientes para inhibir la proliferación de células similares a las epiteliales y promover la diferenciación y proliferación de células similares a las neuronas. Además, el medio se complementa con ácido retinoico y factores de crecimiento específicos que inducen la diferenciación terminal de células similares a neuronas en neuronas maduras que exhiben una morfología ramificada extensa.

Protocolo

1. Consideraciones generales

1. Consulte la Tabla de Materiales/Equipos para obtener una lista de los reactivos necesarios. Realice todos los pasos bajo estrictas condiciones asépticas.
2. Use suero fetal bovino inactivado por calor (hiFBS) para todas las preparaciones de medios que incluyan FBS. Para inactivar el calor, calentar una alícuota de 50 ml de FBS a 56 °C durante 30 min, invirtiendo cada 10 min (ver también Tabla 1).
   nota: Cuando se usa FBS sin inactivación por calor, el fenotipo epitelial progresa más rápidamente a través de los cultivos de células SH-SY5Y.
3. Antes de usar, permita que los medios se calienten y equilibren en una incubadora para establecer un equilibrio de pH adecuado antes de cada paso. Por ejemplo, 50 ml de medio tardan aproximadamente una hora en equilibrarse completamente (pH 7, 37 °C, 5% CO₂).
   nota: Este protocolo utiliza un procedimiento de división de dos pasos que requiere que las células SH-SY5Y parcialmente diferenciadas se tripsinicen y se vuelvan a placar. Este es un proceso estresante para estas células excepcionalmente frágiles. Por lo tanto, es importante incubar las células en tripsina durante un tiempo mínimo. Esto permitirá el despegue preferencial de las neuronas, dejando las células epiteliales aún unidas a la placa.
4. Realice la trituración de las células diferenciadas lentamente con una pipeta de plástico de 10 ml con la punta contra la parte inferior del tubo cónico que contiene las células. Realice la trituración a una velocidad lenta, hacia arriba y hacia abajo no más de cinco veces.
   

>2. Descongelación y cultivo de células de neuroblastoma SH-SY5Y indiferenciadas

1. Prepare los medios básicos de crecimiento.
2. Descongele rápidamente las células congeladas en un baño de agua a 37 °C (aproximadamente 2 min).
3. Vuelva a suspender las células en un medio de crecimiento básico de 9 ml en un tubo cónico de 15 ml y, a continuación, centrifugar durante 2 minutos a 1.000 x g.
4. Aspire el sobrenadante teniendo cuidado de no alterar las células peletizadas, y vuelva a suspender suavemente las células en 10 ml de medios de crecimiento básicos.
5. Coloque las celdas en un matraz T-25 o en un plato de^{60 mm2}.
6. Al día siguiente, reemplace los medios para eliminar las células muertas.

3. Día 0: Enchapado de células para la diferenciación

1. Consulte la Figura 1 para ver el programa de diferenciación.
2. Enjuague las células indiferenciadas con 1x PBS, aspire y luego tripsinícelas con 1-2 ml de tripsina-EDTA calentado al 0,05%.
3. Cuando las células estén en tripsina, incube durante aproximadamente 3 minutos en una incubadora.
4. Apague la tripsina añadiendo 10 ml de medios de crecimiento básicos, enjuague los lados del matraz o plato y triture suavemente de 1 a 3 veces. Transfiera el contenido a un tubo cónico de 15 ml.
5. Centrifugar durante 2 minutos a 1.000 x g y aspirar el medio teniendo cuidado de no alterar el pellet.
6. Vuelva a suspender el pellet en 5 ml de medios de crecimiento básicos y triture de 1 a 3 veces.
7. Cuente las células con un hemocitómetro y, a continuación, diluya con medios de crecimiento básicos hasta 50.000 células/ml.
8. Coloque 2 ml de células por placa de 35 mm² para un total de 100.000 células por placa y vuelva a colocarlas en la incubadora.

>4. Día 1: Cambiar Medios (Medios de Diferenciación #1)

1. Alícuota 50 ml de Medio de Diferenciación #1 (ver Tabla 2) e incubar en un baño de agua a 37 °C.
2. Cuando el medio esté caliente, deje que se equilibre en una incubadora (37 °C, 5% de CO₂) durante al menos una hora para establecer un equilibrio de pH adecuado antes de su uso.
3. Agregue ácido retinoico (RA) (ver Tabla 1) a los medios calentados y equilibrados inmediatamente antes de agregar los medios a los platos.
   nota: El ácido retinoico es sensible a la luz y debe almacenarse en botellas oscuras a 4 °C
4. Aspire suavemente los medios viejos y deséchelos.
5. Agregue 2 ml de Medios de Diferenciación #1 con RA por plato de^{35 mm 2} y devuélvalo a la incubadora.

5. Día 3: Cambiar Medios (Medios de Diferenciación #1)

1. Repita la sección 4 (pasos 1-5)

>6. Día 5: Cambiar Medios (Medios de Diferenciación #1)

1. Repita la sección 4 (pasos 1-5)

>7. Día 7: Celdas divididas 1:1

1. Agregue RA a los medios de diferenciación # 1 calentados y equilibrados inmediatamente antes de agregar medios a los platos.
2. Aspire suavemente los medios viejos y deséchelos.
3. Añadir 200 μl de EDTA calentado al 0,05% 1x tripsina por plato de 35^mm2 y calentar en una incubadora durante aproximadamente 2-3 minutos o hasta que las células se levanten visiblemente de la placa como se observa al microscopio.
4. Apague la tripsina añadiendo 2 ml de Medio de Diferenciación #1 con RA por plato de^{35 mm2} y utilice el medio para enjuagar las células neuronales restantes de la placa. A continuación, transfiera el contenido a un tubo cónico de 50 ml.
   nota: No pruebe demasiados platos a la vez durante los pasos de tripsinización. Esto ayuda a garantizar que los cultivos neuronales no se incuben en tripsina durante demasiado tiempo, lo que puede ser citotóxico.
5. Combine el contenido de hasta 10 platos en el tubo cónico de 50 ml y triture suavemente hacia arriba y hacia abajo no más de cinco veces con una pipeta de plástico de 10 ml.
6. Alícuota 2 ml de suspensión celular en placas frescas de³⁵ mm 2 y devuelva a la incubadora.

>8. Día 8: Cambiar Medios (Medios de Diferenciación #2)

1. Agregue RA (ver Tabla 1) a los medios calentados y equilibrados inmediatamente antes de agregar los medios a los platos.
2. Aspire suavemente los medios viejos y deséchelos.
3. Agregue lentamente 2 mL de medio de diferenciación # 2 (consulte la Tabla 2) con RA por plato de 35^mm2 y regrese a la incubadora. No permita que las neuronas se expongan al aire durante un período prolongado, ya que pueden secarse rápidamente.

>9. Día 9: Preparar platos recubiertos de matriz extracelular (ECM)

1. Descongele un vial de solución de ECM en hielo y diluya 1:100 en DMEM frío.
2. Dispense 2 ml de mezcla en cada plato de 35^mm2 y asegúrese de que toda la base del plato esté cubierta.
3. Colocar en una incubadora (37 °C, 5% CO₂) durante 1 hora o toda la noche.
4. Aspire la mezcla y deje secar al aire durante aproximadamente 1 hora en una capucha. Almacene a temperatura ambiente hasta por 2 meses.

10. Día 10: Transferencia de células a placas recubiertas de ECM 1:1

1. Agregue RA (ver Tabla 1) a los medios calentados y equilibrados inmediatamente antes de agregar los medios a los platos.
2. Aspire suavemente los medios y deséchelos.
3. Agregue 200 μl de tripsina calentada a cada placa de 35^mm2 y deje incubar a temperatura ambiente durante aproximadamente 1-2 minutos o hasta que las neuronas se levanten visiblemente de la placa como se observa bajo un microscopio><. nota: Ejecute este paso de tripsinización a temperatura ambiente para evitar incubar en exceso las neuronas con tripsina y causar daños. Las neuronas se liberan de las placas mucho más rápido que las células epiteliales en esta etapa.
4. Apague la tripsina añadiendo 2 ml de medios de diferenciación #2 por plato de^{35 mm2} y utilice el medio para enjuagar las células neuronales restantes de la placa. A continuación, transfiera el contenido a un tubo cónico de 50 ml.
5. Combine el contenido de hasta 10 platos en el tubo cónico de 50 ml y triture suavemente hacia arriba y hacia abajo no más de cinco veces con una pipeta de plástico de 10 ml.
6. Dispense 2 ml de suspensión celular en placas de³⁵ mm 2 recubiertas de ECM y devuélvalas a la incubadora.

>11. Día 11: Cambiar Medios (Medios de Diferenciación #3)

1. Agregue RA (ver Tabla 1) a los medios calentados y equilibrados inmediatamente antes de agregar los medios a los platos.
2. Aspire suavemente los medios viejos y deséchelos.
3. Agregue lentamente 2 ml de Medio de Diferenciación #3 (ver Tabla 2) con RA por plato de 35^mm2 y regrese a la incubadora. No permita que las neuronas se expongan al aire durante un período prolongado.

>12. Día 14: Cambiar Medios (Medios de Diferenciación #3)

1. Repita la sección 11 (pasos 1-3)

13. Día 17: Último cambio de medios (Medios de Diferenciación #3)

1. Repita la sección 11 (pasos 1-3)

>14. Día 18: Cultivos neuronales listos para usar

1. Cambie el medio a un medio de diferenciación fresco # 3 con AR cada 3 días para mantener la salud de las neuronas.
   nota: Las células deben diferenciarse en neuronas y exhibir un fenotipo neuronal. Por lo general, los cultivos son estables hasta 14 días después de la diferenciación terminal. Sin embargo, la duración de la viabilidad de las neuronas depende del número de paso de las células indiferenciadas al comienzo de la diferenciación. Un mayor número de pasajes produce neuronas diferenciadas con una vida útil más corta.

Tabla 1: Soluciones y componentes en stock.

componente	Detalles	acción	instrucciones
10 μM RA	Ácido retinoico totalmente trans	5 mM	Resuspende 50 mg de RA en 33,3 ml de EtOH al 95%. La artritis reumatoide es sensible al calor, la luz y el aire. Conservar en un frasco oscuro y conservar a 4 °C durante un máximo de 6 semanas. Úselo con una dilución de 1:500 y diluya en medios de diferenciación inmediatamente antes de usar
	(300,44 g/mol)
1x B-27	Suplemento B-27	50 veces	Descongele el frasco de 1-10 ml y el resto de las alícuotas en alícuotas de 1 ml de un solo uso y guárdelas a -80 °C. Almacene los frascos de 10 ml a -20 °C
20 mM KCl	Cloruro de potasio	1 M	Añadir 250 ml de agua a 18,6 g de KCl y filtro estéril. Almacenar a temperatura ambiente
	(74,55 g/mol)
2 mM db-cAMP	dibutiril AMP cíclico	1 M	Vuelva a suspender la botella llena añadiendo 2,04 ml de agua a 1 g de db-cAMP. Sensible a la luz y a la humedad. Almacenar en alícuotas de 100 μl o 200 μl a -20 °C o -80 °C
	(491,37 g/mol)
50 ng/ml BDNF	Factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF)	-	Frasco de centrífuga para que el polvo llegue al fondo. Resuspenda el vial de 10 μg en 1 ml de Neurobasal + 1x B27 o el vial de 5 μg en 0,5 ml de Neurobasal + 1x B27 para obtener 10 μg/ml. Utilizar en dilución 1:200. Almacene las alícuotas de trabajo a -80 °C (ej.: 250 μl)
hiFBS	Suero fetal bovino inactivado por calor	-	Alícuota FBS descongelada en tubos cónicos de 50 ml. Calentar a 56 °C al baño maría durante 30 min. Retire y congele las alícuotas de trabajo a -20 °C

Tabla 2: Recetas de medios.

Medios de crecimiento básicos
componente	Volumen para 500 ml	dilución
EMEM	415 ml EMEM
15% hiFBS	75 ml hiFBS
1x Pluma/Estreptococo	5 ml Pluma/Estreptococo	1:100
2 mM de glutamina	5 ml de glutamina	1:100
*Conservar durante 6 semanas como máximo
Medios de Diferenciación #1
componente	Volumen para 50 ml	dilución
EMEM	48 ml EMEM
2.5% hiFBS	1,3 ml hiFBS
1x Pluma/Estreptococo	500 μl Pluma/estreptococo	1:100
2 mM de glutamina	500 μl de glutamina	1:100
10 μM RA	100 μl RA (culata de 5 mM)	1:500
*Consérvelo durante 2 semanas como máximo y añada AR inmediatamente antes de usarlo
*No guardar medios adicionales una vez que se agrega RA - RA es inestable
Medios de Diferenciación #2
componente	Volumen para 50 ml	dilución
EMEM	49 ml EMEM
1% hiFBS	500 μl hiFBS
1x Pluma/Estreptococo	500 μl Pluma/estreptococo	1:100
2 mM de glutamina	500 μl de glutamina	1:100
10 μM RA	100 μl RA (culata de 5 mM)	1:500
*Consérvelo durante 2 semanas como máximo y añada AR inmediatamente antes de usarlo
*No guardar medios adicionales una vez que se agrega RA - RA es inestable
Medios de Diferenciación #3
componente	Volumen para 50 ml	dilución
Neurobasal	47 ml Neurobasal
1x B-27	1 ml de B-27 (50X caldo)	1:50
20 mM KCl	1 ml de KCl (1M de caldo)	1:50
1x Pluma/Estreptococo	500 μl Pluma/estreptococo	1:100
2 mM GlutamaxI	500 μl de GlutamaxI (100x culata)	1:100
50 ng/ml BDNF	250 μl de caldo de BDNF (10 μg/ml)	1:200
2 mM dibutiril AMP cíclico (db-cAMP)	100 μl db-cAMP (culata 1M)	1:500
10 μM RA	100 μl RA (5 mM de culata)	1:500
*Consérvelo durante 2 semanas como máximo y añada AR inmediatamente antes de usarlo
*No guardar medios adicionales una vez que se agrega RA - RA es inestable

Resultados

Figura 1: Calendario del procedimiento de diferenciación. El proceso de diferenciación consta de 11 pasos repartidos en el transcurso de un período de 18 días. El primer día del protocolo de diferenciación (día 0), se siembran entre 25.000 y 100.000 células en placas de 35 mm sin recubrimiento. En los días 1, 3 y 5, se eliminan los medios antiguos y se aplican los medios de diferenciación #1. En el d...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
B-27	ThermoFisher Scientific	17504-044	Consulte la Tabla 1 para la preparación
Factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF)	sigma	SRP3014 (10 μg)/B3795 (5 μg)	Consulte la Tabla 1 para la preparación
AMP cíclico de dibutiril (db-cAMP)	sigma	D0627	Consulte la Tabla 1 para la preparación
Dmso	ATCC	4-X	-
Águila Mediana Esencial Mínima (EMEM)	sigma	M5650	-
Suero fetal bovino (FBS)	Hyclone	SH30071.03	Consulte la Tabla 1 para la preparación
GlutamaxI	Tecnologías de la Vida	35050-061	-
glutamina	Hyclone	SH30034.01	-
Cloruro de potasio (KCl)	Fisher Científico	BP366-1	Consulte la Tabla 1 para la preparación
Solución de matriz extracelular (ECM) MaxGel	sigma	E0282	Consulte el paso 11 del protocolo
Neurobasal	Tecnologías de la Vida	21103-049	-
Penicilina/Estreptomicina (pluma/estreptococo)	Tecnologías de la Vida	Números 15140-122	-
Ácido retinoico (AR)	sigma	R2625	Debe almacenarse en la oscuridad a 4 °C porque este reactivo es sensible a la luz
Células SH-SY5Y	ATCC	CRL-2266	-
0,5% Tripsina + EDTA	Tecnologías de la Vida	15400-054	-
Antenas Falcon TC de 35 mm	Falcon (una marca de Corning)	353001	-