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1. Cultivo de células madre embrionarias de ratón
- Prepare platos o placas de cultivo celular recubiertos de gelatina al 0,1%.
- Añadir 2 mL de gelatina esterilizada al 0,1% (0,1% p/v en agua) a las placas de cultivo celular de 60 mm. Mece suavemente para asegurar un recubrimiento uniforme de las placas de cultivo celular.
- Coloque las placas en una incubadora de CO2 al 5% a 37 °C y deje reposar durante 1 h.
- Retire la solución de gelatina al 0,1% antes de sembrar las células.
nota: Después de quitar la gelatina, no es necesario secar ni lavar los platos recubiertos.
- Cultivo de células madre embrionarias de ratón (A2lox y 129)
- Incubar las células mESC (A2lox y 129) en las placas de cultivo celular de 60 mm recubiertas de gelatina al 0,1% en un medio de crecimiento mESC a 37 °C en una incubadora de CO2 al 5%, respectivamente. El medio de crecimiento mESC consta de un 85 % de medio y mezcla de nutrientes F-12 (DMEM/F12) modificado por Dulbecco, un 15 % de reemplazo de suero Knock-Out (KSR), 0,1 mM de β-mercaptoetanol (2ME), 2 mM de GlutaMAX, un 1 % de aminoácidos no esenciales (NEAA), un 1 % de penicilina/estreptomicina (P/S), 1000 U/mL de factor inhibidor de la leucemia (LIF), 10 nM de CHIR-99021 (inhibidor de GSK-3) y 0,33 nM de PD0325901 (inhibidor de MEK)
PRECAUCIÓN: β-mercaptoetanol es inflamable y tiene toxicidad por inhalación. Manténgase alejado de fuentes de fuego y use una mascarilla para evitar la inhalación cuando lo use.
- Cambie el medio de crecimiento mESC diariamente para un mejor crecimiento de A2lox y 129.
- Cuando las células alcancen el 80% de confluencia, retire el medio y agregue 1 mL de tripsina al 0,1% al plato. Mece suavemente durante 30 s para asegurar una cobertura uniforme de tripsina en todas las células.
- Deje que las células se tripsinicen durante aproximadamente 1 minuto y luego elimine la tripsina con una pipeta de 1 ml.
- Agregue 2 mL de medio de crecimiento mESC a la placa, pipetee hacia arriba y hacia abajo varias veces para hacer una suspensión de una sola célula.
- Cuente la densidad de las células en la suspensión con la mayor precisión posible usando un hemocitómetro.
- Divida las células en 7 grupos e induzca la diferenciación utilizando diferentes protocolos que se muestran en la Tabla 1.
>2. Diferenciación de mESCs a NPCs
- Prepare placas de cultivo celular recubiertas de gelatina al 0,1% o cubreobjetos.
- Antes de usar, prepare placas de 6 pocillos recubiertas de gelatina al 0,1% o cubreobjetos como en el paso 1.1.
- Diferenciación (Tabla 1)
- Añadir 1,5 x 106 mESCs en una placa bacteriana no adhesiva en 10 mL de medio de diferenciación basal I para permitir la formación de cuerpos embrioides a 37 °C en una incubadora de 5% de CO2.
- Después de 2 días, transfiera los agregados celulares a tubos de centrífuga de 15 ml y déjelos sedimentar por gravedad.
- Retirar el sobrenadante y añadir 10 mL de medio de diferenciación basal I fresco para resuspender los cuerpos embrioides. Vuelva a plantarlos en un nuevo plato bacteriano no adhesivo y permita la diferenciación durante otros 2 días.
- Comprobar la formación de cuerpos embrioides al microscopio (Figura 1A).
- Recoja los cuerpos embrioides como se describe en los pasos 2.2.2-2.2.3. Siembre alrededor de 50 cuerpos embrioides en 2 mL de medio de diferenciación basal I por pocillo en placas de 6 pocillos recubiertas de gelatina al 0,1%.
- Prepare 1 mM de ácido retinoico (RA) totalmente trans (en DMSO) y guárdelo lejos de la luz en un congelador a -80 °C después del subenvasado.
nota: La artritis reumatoide es inestable y se debe prestar atención a mantenerla alejada de la luz y reducir el contacto con el aire durante la preparación de la culata de artritis reumatoide.
- Para la inducción de AR, agregue 2 μL de caldo de RA en cada pocillo para obtener una concentración final de 1 μM.
- Coloque la placa en la incubadora de CO2 al 5% a 37 °C y diferencie durante otros 4 días.
- Cambie los 2 mL completos del medio de diferenciación basal I (con 1 μM de AR) cada 2 días.
Tabla 1: Detalles del protocolo utilizado en la diferenciación.
| protocolo | Medio |
| 4 días de formación de cuerpos embrioides + 4 días de inducción de AR | Medio de diferenciación basal:
DMEM/F12 +15%FBS + 1%NEAA+0.1mM 2ME+ 1%P/S |
