Diferenciación de Células Progenitoras Neurales en Neuronas

Resumen

Fuente: Mao, X., et al. Diferenciación neuronal de células madre embrionarias de ratón in vitro. J. Vis. Exp. (2020).

El video mostró un método de cultivo celular para diferenciar células progenitoras neurales en neuronas. Al incubar las células en un medio rico en nutrientes complementado con factores de crecimiento, las células progenitoras maduraron hasta convertirse en neuronas con axones y dendritas desarrollados. Un agente estabilizador garantizaba la viabilidad celular y protegía contra el daño oxidativo durante todo el proceso de diferenciación.

Protocolo

>1. Diferenciación de NPCs a neuronas (Fase II)

1. Siembre alrededor de 5 x 10^{5 células} madre embrionarias de ratón o derivados de mESC dentro de los 2 mL del medio de diferenciación basal I por pocillo en las placas de 6 pocillos recubiertas de gelatina al 0,1%. Divida aleatoriamente los derivados de mESC en 3 grupos, como protocolo de fase II 1, protocolo 2 y protocolo 3, respectivamente.
2. Coloque la placa en la incubadora de CO₂ al 5% a 37 °C para permitir la fijación durante 6 h. Lávelas dos veces con 2 mL de PBS.
3. Agregue 2 mL de medio de diferenciación basal I, N2B27 medio I y N2B27 medio II (Tabla 1), respectivamente, a cada pocillo de los grupos anteriores.
4. Coloque las placas en la incubadora y deje que se diferencien durante otros 10 días. Cambie el medio correspondiente cada 2 días.
5. Verifique el estado de diferenciación y registre los cambios morfológicos como se mencionó en el paso 3.
6. El día 18, evalúe la generación de neuronas (β-Tubulina III positiva) y determine la eficiencia de diferenciación de los 3 protocolos utilizados en el paso 4.

Resultados

Tabla 1: Detalles de los 3 protocolos utilizados en la diferenciación de fase II.

Fase de Diferenciación II (10d)
	protocolos	Medio
Protocolo 1	Diferenciación natural: Con el medio de diferenciación basal solo I	Medio de difer...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Anticuerpo anti-β-Tubulina III producido en conejo	Sigma Aldrich	T2200	almacenado a -80 °C, evite la congelación y descongelación repetidas
Suplemento B-27 (50X), sin sérum	Gibco	17504044	se almacenan a -20 °C y se protegen de la luz
DME/F-12 1:1 (1x)	HyClone	SH30023.01B	almacenado a 4 °C
Suero fetal bovino	HyClone	SH30084.03	almacenado a -20 °C, evite la congelación y descongelación repetidas
Microscopía de fluorescencia	Olimpo	CKX53
gelatina	Gibco	CM0635B	Almacenado a temperatura ambiente
Suplemento GlutaMAX	Gibco	35050061	almacenado a 4 °C
Tampón de dilución de anticuerpos primarios de tinción	Beyotime	P0103	almacenado a 4 °C
KnockOut DMEM/F-12	Gibco	12660012	almacenado a 4 °C
MEM Solución de aminoácidos no esenciales	Gibco	11140076	almacenado a 4 °C
Suplemento N-2 (100X)	Gibco	17502048	almacenado a -20 °C y protegido de la luz
Suero de cabra normal	Jackson	005-000-121	almacenado a -20 °C
Medio Neurobasal	Gibco	21103049	almacenado a 4 °C
Plato bacteriano no adhesivo	Corning	3262
Solución salina tamponada con fosfato (1X)	HyClone	SH30256.01B	almacenado a 4 °C
Solución de penicilina/estreptomicina	HyClone	SV30010	almacenado a 4 °C
PD0325901(Mirdametinib)	Selleck	S1036	almacenado a -20 °C
Ácido retinoico	sigma	R2625	almacenado a -80 °C y protegido de la luz
Cepa 129 células madre embrionarias de ratón	Cyagen	MUAES-01001	Mantenido en un sistema de cultivo sin alimentadores
2-Mercaptoetanol	Gibco	21985023	almacenado a 4 °C y proteger de la luz
4% de paraformaldehído	Beyotime	P0098	almacenado a -20 °C
6 - Placa de pocillos	Corning	3516
Placa de cultivo celular de 60 mm	Corning	430166
Tubo de centrífuga de 15 ml	Nunc	339650

inmunológica