Todos los procedimientos relacionados con la recolección de muestras se han realizado de acuerdo con las directrices del IRB del instituto.
1. Disociación sensorial de los ganglios
- Pipetear 500 μl de solución de disociación de ganglios (GaDS) (Tabla 1), dejando los ganglios en el tubo. Lave los ganglios una vez agregando 1 ml de solución tampón de fosfato (PBS), espere a que los ganglios se asienten en el fondo del tubo y luego pipetee el PBS.
- Añadir 1 ml de GaDS y 22 μl de enzima digestiva (mezcla de colagenasa I/II y proteasa, 2,5 mg/ml en agua) a cada tubo.
- Añada 20 μl de Fast Blue (5,26 mM) al tubo de control positivo.
- Coloque los tubos en un baño de agua o bloque calefactor a 37 °C.
- Cada 15 minutos, agite brevemente los tubos y gírelos para asegurarse de que los ganglios estén cubiertos por la solución><.
nota: El tiempo de digestión de los ganglios depende de la edad de la enzima de digestión. Dentro de un mes de disolver la enzima de digestión, digiera durante 30 minutos; Dentro de 2 a 6 meses, digerir durante 45 min. Si la enzima tiene más de seis meses, digiera los ganglios durante 60 minutos.
- Mientras se digieren los ganglios, prepare gradientes de densidad utilizando una solución de partículas (partículas de sílice coloidal recubiertas con polivinilpirrolidona).
- Mezclar solución de partículas al 12% en GaDS, 500 μl por muestra.
- Mezclar una solución de partículas al 28% en GaDS, 500 μl por muestra.
- Agregue lenta y cuidadosamente 400 μl de solución de densidad al 12% sobre 400 μl de solución de densidad al 28% en un tubo nuevo de 1,5 ml para cada muestra. No permita que las dos capas se mezclen. Dos capas distintas deben ser visibles en el tubo, una más oscura que la otra.
- Después del tiempo de digestión adecuado, retire GaDS con enzima digestiva y lave los ganglios dos veces con 1 ml de PBS. Añadir 200 μl de GaDS fresco a cada tubo.
- Utilice una pipeta de 200 μl, ajustada a un volumen de 100 μl, y pipetee los ganglios hacia arriba y hacia abajo varias veces para separar las células. Repita hasta que no se vea ningún trozo de tejido intacto. Evite crear burbujas en la solución.
- Pase las células disociadas a través de un filtro de células de 70 μm.
- Agregue otros 100 μl de GaDS al tubo de disociación original para recoger las células perdidas restantes y pasar la solución adicional a través del filtro de células. Con una nueva punta de pipeta, recoja cualquier resto de líquido que contenga células que haya pasado a través del colador y se haya adherido a la malla. El volumen final de células suspendidas en GaDS es de 300 μl.
- Coloque con cuidado los 300 μl de células sobre el gradiente de densidad previamente creado. Evite las burbujas y la mezcla de células con las capas de densidad.
- Centrífuga durante 10 min a 2.900 x g a RT.
- Una vez finalizada la centrifugación, retire con cuidado y deseche la capa superior de 700 μl. Esta capa contiene la mayoría de los restos de células que, de otro modo, interferirían con la clasificación de células.
- Añada 700 μl de GaDS fresco a la solución que contiene la célula restante y pipetee hacia arriba y hacia abajo varias veces para mezclar.
- 18. Centrifugar durante 15 minutos a 2.900 x g a las celdas de pellets.
- 19. Una vez finalizada la centrifugación, retire con cuidado y deseche el sobrenadante, dejando el pellet de la celda.
- Vuelva a suspender el pellet de celda en GaDS de 200 a 300 μl pipeteando hacia arriba y hacia abajo con una pipeta de 1.000 μl ajustada a 200 μl varias veces. Ponga las muestras en hielo.
Tabla 1. Mezcla de reactivos para la solución de disociación de ganglios (GaDS).
| ingrediente | importe |
| DMEM/f12 avanzado | 9,5 ml |
| glutamina | 100 μl |
| HEPES (10 mM) | 100 μl |
| Suplemento de N2 | 100 μl |
| B27 (sin vitamina A) | 200 μl |
| NGF (50 μg/ml) | 10 μl |
