Todos los procedimientos relacionados con la recolección de muestras se han realizado de acuerdo con las directrices del IRB del instituto.
NOTA: El siguiente protocolo describe el método de preparación y cultivo para la incubación a largo plazo y la obtención de imágenes intermitentes de cortes de hipocampo. Un solo corte del hipocampo se une a un cubreobjetos fotograbado especialmente preparado con un coágulo de plasma, y luego los cubreobjetos se sellan en el lado plano de un tubo de rodillo perforado, que se mantiene en una incubadora de rodillos.
1. Preparación de la estantería de tubos de rodillos
- Utilice la plantilla que se muestra en la Figura 1A impresa al tamaño que se muestra en la barra de escala. Con un clavo, perfora pequeños agujeros (lo suficientemente grandes como para un marcador de punta fina) en la plantilla centrados en los agujeros.
- Coloque la plantilla en el fondo de una placa de cultivo de tejidos de 15 cm (diámetro nominal de 14 cm) y marque la posición de los orificios. Repita esto en un segundo plato.
- Con brocas diseñadas para su uso en plástico, taladre seis orificios de 1,5 cm de diámetro en cada plato en una matriz hexagonal (4,8 cm de centro a centro) con centros de orificios a 2,5 cm del borde del plato. Taladre tres orificios (3 mm de diámetro) a 12 mm del borde que se colocan equidistantes entre dos de los orificios más grandes, como se muestra en la Figura 1A.
- Con la parte inferior de cada plato enfrentada, coloque un tornillo de metal de 2,5 pulgadas de largo (3/16 de pulgada de diámetro) con una arandela plana a través de uno de los orificios pequeños, seguido de una segunda arandela plana, un trozo de tubo de polietileno (espaciador, 4,7 cm), otra arandela plana, la segunda placa de cultivo de tejidos, otra arandela plana, una arandela de bloqueo, y una nuez.
- Repita el paso 1.4 en los otros dos tornillos de la máquina y apriételos solo sin apretar hasta que todos los tornillos de la máquina estén en su lugar. A continuación, apriete bien las tuercas.
- Coloque los ojales (5/16 de pulgada de grosor, 5/8 de pulgada de diámetro del orificio) en los orificios del plato inferior para obtener el estante final del tubo de rodillo (Figura 1B; se muestra con dos tubos en su lugar). Coloque una pegatina en cada estante con un número único.
>2. Preparación de tubos de rodillos y cubreobjetos
- Fabricación de la plantilla para perforar el agujero en los tubos de rodillos
- Taladre un orificio de 1,5 cm y 8 cm de profundidad en el lado central de un bloque de madera de 2 x 4 x 5,5 pulgadas en un ángulo tal que el lado plano del tubo del rodillo quede casi paralelo al bloque cuando se inserte (Figura 2A).
- Amplíe el orificio con una lima de madera redonda para ensanchar y estrechar el orificio para permitir la inserción del tubo (los tubos de rodillo tienen un diámetro ligeramente mayor cerca del extremo de la tapa) (Figura 2B).
- Taladre un orificio vertical de 1,5 cm de diámetro, a 5,5 cm del lado del bloque, y centrado sobre el orificio lateral (Figura 2C).
- Cuando el orificio lateral esté lo suficientemente cónico, inserte un tubo de rodillo que esté marcado en el lugar deseado para centrar el orificio para la rebanada y coloque el tubo de modo que el punto marcado quede centrado en el orificio vertical de 1,5 cm.
- Retire el tubo y mida la distancia desde el punto hasta el extremo del tubo. Marque esta distancia desde el centro del orificio en la plantilla e inserte un clavo para proporcionar un tope para colocar correctamente el tubo para perforar (flecha en la Figura 2C).
- Use una sierra para metales para cortar el clavo al ras de la superficie del bloque de madera para evitar lesiones.
- Agregue clips de resorte en la parte inferior de la plantilla si hay una taladradora con ranuras que permitan anclarla (Figura 2D, flecha negra). De lo contrario, use abrazaderas en C para sujetar la plantilla de forma segura en la taladradora.
- Usando la plantilla descrita anteriormente para sujetar y posicionar un tubo de cultivo de plástico de 11 cm de lado plano con el lado plano hacia arriba (Figura 2A), perfore un orificio de 6 mm de diámetro con el centro a 1,0 cm de la parte inferior y centrado entre los lados del tubo.
nota: Se debe utilizar una broca diseñada para plástico.
- Con una herramienta de desbarbado giratoria, alise los bordes del orificio (Figura 2E) y haga 4 ranuras en el borde interior del orificio (Figura 2E, recuadro) para facilitar el drenaje del orificio durante la rotación.
- Con una perforadora de 12 mm, corte discos de 12 mm de diámetro a partir de láminas de caucho de silicona adhesivas de doble cara no tóxicas. Con una perforadora de papel estándar de un orificio (6 mm de diámetro), haga un agujero en el centro de cada disco.
- Enjuague los tubos perforados con etanol al 70%, séquelos al aire en una cabina de seguridad biológica y esterilice los tubos y los discos adhesivos perforados durante 40 minutos bajo la lámpara ultravioleta (UV) (30 W a una distancia media de 70 cm) en la cabina de seguridad biológica.
- Vuelva a colocar los tubos y discos después de 20 minutos para que todas las superficies expuestas estén esterilizadas. En condiciones estériles, retire el soporte blanco de un disco adhesivo y fije el caucho de silicona al exterior de un tubo, alineando los orificios (Figura 2F).
cautela: Para evitar la exposición a los rayos UV, use protección para los ojos y cierre el gabinete antes de encender la lámpara UV.
- Cubreobjetos limpios de vidrio alemán de 12 mm de diámetro fotograbados (100 cuadrados numerados en el centro de 1 mm). Sostenga los cubreobjetos suavemente con pinzas y sumérjalos en etanol absoluto, seguido de agua, seguido de etanol absoluto nuevamente, y finalmente sumerja los cubreobjetos en una llama para quemar el etanol. Deje que los cubreobjetos se enfríen.
- Sujetando los cubreobjetos con pinzas, sumérjalos en 3-aminopropiltrietoxisilano al 2% en acetona durante 10 s. Enjuague los cubreobjetos con agua ultrapura y déjelos secar al aire.
- Coloque los cubreobjetos en papel de filtro estéril dentro de una cabina de seguridad biológica y encienda la luz ultravioleta. Exponga cada lado de los cubreobjetos durante 20 min.
cautela: Para evitar la exposición a los rayos UV, use protección para los ojos y cierre el gabinete antes de encender la lámpara UV.
>3. Preparación de la rebanada del hipocampo
- Antes de comenzar la disección, prepare mitades de hojas de afeitar de doble filo para el picador de tejidos. Dobla las cuchillas a lo largo con cuidado con los dedos y róchalas por la mitad.
- Enjuague las mitades de la hoja con acetona con un hisopo de algodón para limpiarlas, seguido de un enjuague con etanol absoluto y secado al aire. Antes de montar una media cuchilla en la picadora de pañuelos, esterilícela enjuagándola con etanol al 70%.
- Siga los protocolos aprobados por el Comité institucional de Cuidado y Uso de Animales; después de la anestesia con isoflurano, eutanasiar por decapitación a un cachorro >nota: El protocolo de cultivo de cortes de cerebro es independiente de la cepa o genotipo de ratón o rata. Se han utilizado muchas líneas de ratones transgénicos con diferentes antecedentes genéticos.
- Enjuague la cabeza con etanol al 70% y colóquela en una placa de Petri de 60 mm. Hasta el montaje final de la rebanada de cerebro en el tubo del rodillo, todos los pasos siguientes se realizan en una campana de flujo laminar para mantener la esterilidad.
- Con una cuchilla quirúrgica # 21, haga un corte sagital a través de la piel y el cráneo. Con una pinza Dumont #5, retira la piel y el cráneo para exponer el cerebro.
- Con pinzas cerradas, extraiga suavemente todo el cerebro, liberándolo pellizcando con las pinzas a través del tronco encefálico detrás del cerebelo. Coloque el cerebro en un plato estéril de 60 mm que contenga 4 °C de solución salina equilibrada de Gey/0,5% de glucosa (GBSS/glucosa).
- Usando un microscopio de disección para visualizar el cerebro (Figura 3A), coloque el cerebro con el lado dorsal hacia arriba y corte el tercio frontal del cerebro y el cerebelo con una cuchilla quirúrgica (Figura 3B).
- Con pinzas, sostenga el lado posterior del cerebro recortado hacia arriba y el lado ventral contra el lado de la placa de Petri para mayor estabilidad. Retire suavemente las meninges alrededor de la línea media sagital y retire el tejido del mesencéfalo con una pinza Dumont #5 de punta fina (Figura 3C, círculo discontinuo).
- Haga dos cortes a lo largo del costado del cerebro para abrirlo (Figura 3C, líneas discontinuas). Una vez que el cerebro se coloca con el lado dorsal hacia abajo y se abre, la fisura del hipocampo debe ser visible (Figura 3D, flecha).
- Transfiera el cerebro abierto esparcido a un trozo de película plástica de policlorotrifluoroetileno y colóquelo para cortarlo en la etapa de un picador de tejidos. Humedece la cuchilla con GBSS/glucosa y corta el hipocampo en rodajas de ~300 μm de grosor.
- Con una pipeta de transferencia, enjuague el cerebro cortado de la película de plástico y colóquelo en un plato nuevo de 60 mm que contenga GBSS/glucosa (Figura 3E). Pellizque suavemente y separe, con pinzas de punta fina, las meninges restantes y otro tejido no hipocampal (Figura 3F) de las rodajas (Figura 3G, H).
>4. Rebanadas de chapado
- Una vez que se hayan obtenido las lonchas, coloque 2 μL de plasma de pollo en el centro del lado fotograbado de un cubreobjetos preparado. Extienda ligeramente el plasma para lograr un punto de 3-4 mm de diámetro.
nota: El lado del fotograbado es la parte superior del cubreobjetos cuando se ve a través de un microscopio de disección, de modo que los números estén orientados correctamente.
- Transfiera 1 rebanada de cerebro con una espátula estéril de punta estrecha (Figura 4A) a la mancha de plasma (Figura 4B). Use pinzas cerradas para mantener la rebanada en la punta de la espátula mientras levanta la rebanada del GBSS/glucosa.
- Toque con la espátula el punto de plasma en el cubreobjetos y, con pinzas cerradas, empuje la rebanada sobre el cubreobjetos.
- Mezcle 2,5 μL de plasma con 2,5 μL de trombina en un tubo separado. Coloque rápidamente 2,5 μL de esta mezcla sobre y alrededor de la rebanada y pipetee hacia arriba y hacia abajo suavemente para mezclarla (Figura 4B).
nota: El plasma se coagulará en 10-15 segundos, por lo que esto debe hacerse rápidamente. Si la adherencia de la rebanada es un problema, mezcle 5 μL de plasma con 5 μL de trombina y use 4-5 μL en la rebanada, retirando un poco después de mezclar para que la rebanada quede plana sobre el cubreobjetos.
- Retire la cubierta de plástico transparente del lado expuesto del adhesivo de caucho de silicona previamente adherido a un tubo de rodillo y coloque el cubreobjetos con la rebanada de cerebro sobre el adhesivo alineando la rebanada dentro del orificio (Figura 4C).
- Para garantizar la adherencia, aplique una presión suave y uniforme al cubrecubreobjetos con el pulgar presionando el cubrecubreobjetos de manera uniforme y sosteniéndolo durante aproximadamente 1 minuto mientras lo transfiere al gabinete de seguridad biológica.
- En una cabina de seguridad biológica, agregue 0.8 mL de medio de cultivo Neurobasal A completo (Tabla de Materiales) a cada tubo (Figura 4D).
- Haga fluir una mezcla de aire al 5 % de CO2/95 % a través de una pipeta Pasteur estéril con tapón de algodón sujeta de forma segura por una abrazadera. Enjuague el tubo del rodillo con la mezcla de gases y tape rápidamente el tubo a medida que se retira de alrededor de la pipeta.
- Etiquete los tubos con el número de rebanada y el número de rejilla. Inserte los tubos en una rejilla de rodillos, asegurándose de que estén geométricamente equilibrados. Si hay un número impar de tubos, agregue tubos para equilibrar.
- Coloque las estanterías en una incubadora de rodillos a 35 °C con rodillos girando la estantería de rodillos a unas 10-13 revoluciones por hora (RPH) (Figura 4E). Para mantener el medio en el fondo de los tubos, incline la incubadora hacia atrás aproximadamente 5° elevando su frente sobre una tabla.
